UniversityAgro.ru » Земледелие » Азотфиксация

Азотфиксация

Азотфиксация, или микробиологическая фиксация атмосферного азота — процесс поглощения микроорганизмами почвы азота атмосферы и трансформация его в органические и минеральные вещества.

Изучением азотфиксации занимались Ж. Буссенго, М. Бейерник, Г. Гельригель, Г. Вильфорт, М.С. Воронин, С.Н. Виноградский, В.Л. Омелянский, Д.Н. Прянишников, Д.И. Менделеев, К.А. Тимирязев.

«Немного найдется явлений, где бы так ясно определилась взаимная роль теории и практики, как в тех исследованиях, в которых научные вопросы о происхождении азота у растений неразрывно сливались с чисто практическими вопросами о пользе возделывания клевера и вообще бобовых».

К.А. Тимирязев, 1890 г.

Отечественная сельскохозяйственная наука уделяла большое внимание изучению явления азотфиксации: создана коллекция наиболее эффективных штаммов микроорганизмов, с конца 50-х годов ведутся генетические и генетико-селекционные исследования, которые впервые в отечественной литературе освещены в монографии «Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции» под редакцией И.А. Тихоновича и Н.А. Проворова в 1998 г.

Значение азотфиксации

На долю азота в атмосферном воздухе приходится 78,09%. Над 1 гектаром суши или водной поверхности Земли содержится около 80 тыс. т азота, который недоступен большинству высших растений.

Атомы азота в молекуле N2 соединены очень прочной тройной связью N≡N,  поэтому разрыв этой связи сопряжен с большими затратами энергии. В промышленности этот процесс с образованием аамиака происходит при высоких температурах и давлении, тогда как в биологических системах — при нормальном атмосферном давлении и температуре.

В зависимости от источников энергии азотфиксирующие микроорганизмы относят к: автотрофам и гетеротрофам.

По оценкам, суммарный объем азотфиксации в год в наземных экосистемах составляет 175-190 млн т азота, 90-110 млн т из которых приходятся на почвы сельскохозяйственных угодий (Мишустин, 1983). При этом ежегодный вынос азота из почвы с сельскохозяйственной продукцией составляет 110 млн т.

Интенсивность азотфиксации

Опыт, проведенный Б.А. Ягодиным совместно с Ю.Я. Мазелем и Ю.Г. Сазоновым в 1981 г. показал зависимость симбиотической азотфиксации от обеспеченности растений азотом и интенсивности фотосинтеза. В этом опыте, люпин сорта Быстрорастущий 4 выращивали при разных уровнях обеспеченности азота и 1-, 3- и 6-суточном затенении. Освещенность изменялась в 1000 раз. Затенение приводило к снижению азотфиксации, в большей степени — при высоком содержании минерального азота. После 6-суточного затенения азотфиксация в варианте без азота снизилась в 40 раз, в варианте с половинной дозой — полностью прекратилась, при двукратных дозах — азотфиксация остановилась уже после 3-суточного затенения.

Максимум интенсивности азотфиксации отмечался в фазе цветения в вариантах без азота и половинной дозой. В фазе бутонизации при половинной дозе она была больше, чем в варианте без азота. Это объясняется тем, что небольшая стартовая доза азота способствует лучшему развитию клубеньков на ранних этапах развития. В фазе цветения в варианте без азота этот показатель был выше, чем в вариантах с азотом.

В фазе бутонизации максимум азотфиксации в дневном цикле приходился на утренние часы (8 ч), причем в варианте с половинной дозой фиксация проходила быстрее, чем в варианте без азота. В фазе цветения максимум приходился на полдень. В этом случае она была наибольшей в варианте без азота. При повышенной дозе азота этот показатель уменьшался во все фазы развития.

Более интенсивное поступление продуктов, меченных 14С, отмечалось в варианте без азота. При двойной дозе оно было на 20% меньше. Через 30 мин после экспозиции метка обнаруживалась в клубеньках обоих вариантов (0,37 и 0,07 соответственно, от общей активности). За 2,5 ч в варианте без азота в клубеньки поступило в 7 раз больше продуктов, чем в варианте с азотом, в корни — в 5 раз, в стебли — в 2 раза больше.

Неодинаковая скорость поступления продуктов фотосинтеза в корневые клубеньки при разных уровнях азотного питания повлияла на интенсивность азотфиксации. Вследствие накопления продуктов фотосинтеза в варианте с азотом затенение в течение 3 суток подавило азотфиксацию клубеньков.

Таким образом, затенение люпина приводит к снижению фиксации азота, но в варианте на фоне минерального азота это снижение больше, чем без азота.

Коэффициент азотфиксации составляет от 0,3 до 0,85.

Интенсивность азотфиксации свободноживущими бактериями зависит от запасом легкодоступных органических веществ, служащих источником энергии. Например, активность азотфиксации в прикорневой зоне растений за счет ассоциативной азотфиксации в 3-200 раз больше, чем в почвах междурядий. Поэтому растения является главным фактором деятельности диазотрофных бактерий в ризосфере благодаря корневой экссудации и корнеопада, объем которых составляет от 25 до 50% продукции фотосинтеза.

Интенсивность фиксации азота диазотрофов определяется выделительной деятельностью корневых систем растений, то есть, в конечном счете от фотосинтетической активности.

Высокая активность в ризосфере многих тропических растений связана со способность использовать при фотосинтезе путь С-4-дикарбоновых кислот. Растениям этого типа требуют интенсивного освещения, а максимальная скорость фотосинтеза у них значительно выше, чем у растений, использующих цикл Кальвина (С-3-тип). Так как растениями с С-4-типом расходуется меньшее количество углеводов на фотодыхание, их часть используется для роста корней и корневой экссудации.

Несимбиотическая азотфиксация изучалась многими исследователями, однако о ее масштабах в различных почвенно-климатических зонах информации мало, в связи с тем, что в природных условиях этот процесс зависит от ряда динамичных факторов среды.

Так, согласно ряду исследований плодородных почв рисовых полей показано, что в результате несимбиотической фиксации под рисом накапливаться 60-70 кг/га азота в год. Причем в затопляемых почвах фиксируется 57-63 кг/га азота, а в незатопляемых — 3-7 кг/га, без растений в затопленных почвах — 23-28 кг/га азота.

За 3 месяца вегетации азотфиксация в почвах рисовых полей Краснодарского края составляла 9-27 кг. Внесение соломы в почву способствует размножению различные группы азотфиксирующих бактерий и росту азотфиксации до 20-40 кг/га в месяц. Влажность также способствует усилению активности при разложении соломы и целлюлозы. В интразональных почвах избыточного увлажнения, то есть пойменных, болотных почвах и рисовых плантациях, активность наиболее высока — от 16,5 до 67,5 кг/га в месяц. В почвах тропической зоны несимбиотическая азотфиксация в среднем составляет 200 кг/га в год, достигая иногда 600 кг/га в год.

Активность несимбиотической азотфиксации зависит также: влажности, температуры, гранулометрического состава почвы, степени аэрированности корнеобитаемого слоя, содержания углекислого газа, наличия макро- и микроэлементов. Минеральные удобрения, известкование, воздушный режим также влияют на интенсивность, но, высокая эффективность отмечается, когда влажность, температура и органическое вещество не лимитируют азотфиксацию. Внесение в дерново-подзолистые почвы растительных остатков позволяет увеличить азотфиксирующую активность в 2-5 раз при условии достаточного увлажнения.

Минеральные азотные удобрения оказывают регулирующее действие на азотфиксацию. В опытах in vitro доказано торможение азотфиксации при наличии связанного азота (при отсутствии растений).

Торможение отмечается при дозах связанного азота более 500-1000 кг/га. Дозы удобрений, которые как правило используются в земледелии, вызывают кратковременное подавление азотфиксации. В то же время, азотные удобрения стимулируют развитие растений, повышают продуктивность фотосинтеза и увеличивают масштабы экзоосмоса, способствуя тем самым ассоциативной азотфиксации на последующих стадиях развития растения, когда избыток минерального азота удобрений в почве значительно снизится.

Применение радиометрического метода в исследованиях количества органического вещества в пожнивно-корневых остатках позволило выявить, что за счет корневых выделений в течение вегетации и постоянного отмирания части корневой системы после уборки растений в почве остается в 3-4 раза больше органического вещества, чем при определении этого показателя обычными методами. При расчете органического вещества следует также учитывать прижизненно отмершие надземные органы растений.

В симбиозе с клубеньковыми бактериями бобовые культуры способны удовлетворять до 60-90% своей потребности в азоте. Однолетние зернобобовые культуры, например, люпин, горох, за сезон связывают 50-100 кг/га азота, половина которого остается в почве, многолетние бобовые травы (клевер, люцерна) — 180-300 кг/га, из которого с корнями и пожнивными остатками остается в почве 70-100 кг/га.

Азотфиксирующие бактерии

Автотрофные азотфиксаторы — цианобактерии и фотосинтезирующие анаэробные бактерии. Имеют значение только в условиях переувлажнения и на затопленных почвах, где фиксация достигает 20-50 кг/га азота в год.

Гетеротрофные азотфиксирующие бактерии распространены на всех типах почв в ризосфере и филлосфере растений. Из этой группы хорошо изучены клубеньковые бактерии и их роль в азотном питании бобовых растений и обогащении почв азотом. Вклад других гетеротрофных симбиотических азотфиксаторов, например, эндосимбионты ольхи, облепихи, еще плохо изучен.

Несимбиотические гетеротрофные азотфиксирующие бактерии также мало изучены, хотя азотфиксирующая способность микроорганизмов была открыта именно у представителей этой группы. В почвах зоны умеренного климата они связывают до 3-5 кг/га азота в год. Выявлено большое видовое разнообразие и широкое их распространение в почвах всех климатических зон, в ризосфере и на поверхности растений, в водоемах, илах и осадках, в кишечнике насекомых, рыб и высших животных.

Способность к азотфиксации обнаружена у большого числа бактерий различных систематических групп. Помимо азотобактера, клостридий и клубеньковых бактерий, этой способностью обладают группы бактерий: Arthrobacter, Bacillus, Erwinia, Klebsiella и др. Чистые культуры эукариотных микроорганизмов, в том числе грибы и дрожжи, не обладают азотфиксирующей активностью, однако смешанные культуры азотфиксаторов с эукариотами отличаются повышенной нитрогеназной активностью.

Активная деятельность клубеньковых бактерий определяется розовой или красной окраской клубеньков, при небольшой активности клубеньки имеют белую или бледно-зеленую окраску. Для активизации их деятельности семена зернобобовых культур обрабатывают бактериальными удобрениями, например, ризоторфином или нитрагином.

Клубеньковые бактерии представляют собой палочки, в свободном состоянии — строгие аэробы и не способны усваивать азот воздуха. Установлено несколько видов клубеньковых бактерий, отличающихся по типу отношения к растению-хозяину. Некоторые виды бактерий способны заражать группу бобовых растений, другие очень специфичны и вступают в симбиоз только с отдельными культурами.

Ассоциативная азотфиксация

Ассоциативная азотфиксация — фиксация азота в фитоплане, то есть ризосфере и филлосфере небобовых растений. Впервые, возможность азотфиксации в прикорневой зоне небобовых культур, была предсказана в 1926 г. С.П. Костычевым, впоследствии экспериментально подтверждена исследованиями с использованием балансового метода (Брэдбокский опыт (Англия), опыт Прянишникова, опыт «вечная» рожь (Германии)).

Бессменное выращивание небобовых культур не приводило к значительному снижению содержания азота в почве, несмотря на его ежегодное отчуждение с урожаем, в тоже время в пару количество азота непрерывно уменьшалось. При ассоциативной азотфиксации микроорганизмы и растения не вступают в такое взаимодействие, как в симбиотических системах, однако, в целом, имеет те же особенности: активность азотфиксации изменяется по мере развития растений, максимум достигается в периоды бутонизации и цветения, снижается при созревании.

Изначально внимание было уделено взаимодействию азотфиксирующих бактерий (Spirillum, Lipoferum, Azospirillum brasilense и др.) с корневой системой тропических злаковых растений. Однако утверждение об уникальности свойств азоспирилл оказалось преувеличенным. В настоящее время известно о фиксации азота ризосферой риса, кукурузы, сорго, пшеницы, некоторых видов тропических трав. Известно свыше 200 видов небобовых растений, способных к азотфиксации с помощью ризосферных микроорганизмов.

Ассоциативная азотфиксация имеет большую экологическую значимость, именно за счет нее происходит пополнение фонда доступного азота в большинстве природных экосистем. Однако клубеньковые бактерии (Rhizobium) в симбиозе с бобовыми культурами показывают наибольшую эффективность: в оптимальных условиях биологическая фиксация азота достигает свыше 300 кг/га в год.

Механизм биологического связывания азота

В конце прошлого столетия высказывались разные предположения о механизмах связывания азота. Рассматривали два варианта — окислительный и восстановительный. Д.Н. Прянишников считал, что переход N2 в NНз через оксиды азота невозможен, так как противоречит принципу допустимой экономии энергии организмов. С.Н. Виноградский в конце прошлого века высказал предположение о способе восстановительного связывания молекулярного азота до аммиака.

«Механизм процесса усвоения азота представляется в данном случае как действие водорода в момент его выделения на газообразный азот в живой протоплазме клетки. Гипотеза о том, что синтез аммиака является непосредственным результатом этого процесса, кажется нам обоснованной».

С.Н. Виноградский «Об усвоении микробами газообразного азота атмосферы»

П.А. Костычев развил теорию С.Н. Виноградского о восстановительной фиксации молекулярного азота через аммиак. В настоящее время этот механизм считается общепризнанным.

Гипотетическая схема превращения азота
Гипотетическая схема превращения азота

Основным ферментом, отвечающим за азотфиксацию является нитрогеназа. У бобовых культур она сосредоточена в клубеньковых бактериях. Трудности по выделению этого фермента из клеточных организмов, долгое время задерживало изучение биохимических процессов азотфиксации. Выделить нитрогеназу можно только в отсутствии воздуха.

Впервые бесклеточные экстракты из клубеньков сои получены в 1968 г. в лаборатории Эванса. В СССР впервые был выделен ферментный комплекс (нитрогеназа) из бактероидов клубеньков люпина и сои в 1970 г.

Нитрогеназа состоит из двух белковых структур: одна — с молекулярной массой 164 000, содержит молибден и железо, вторая — с молекулярной массой 56 000, содержит только железо. По отдельности эти структуры не фиксируют молекулярный азот.

У большинства микроорганизмов нитрогеназа инактивируется кислородом, причем Fе-белок обладает большей чувствительностью к кислороду, чем Мо-Fе-белок. Fе-белок также очень чувствителен к холоду и инактивируется при температуре 0 °С. Для биохимической реакции восстановления азота необходимо наличие АТФ, источника электронов и ионов Мg2+. Большинство ученых считают, что на фиксацию 1 молекулы азота расходуется 15 молекул АТФ.

Отличительная особенность нитрогеназы — способность восстанавливать не только молекулярный азот, но и другие молекулы с тройной связью. Эта особенность позволила использовать метод определения азотфиксации по восстановлению ацетилена (HC≡CH) в этилен (H2C=CH2).

Биохимия нитрогеназы до конца не изучена. Например, не известно, как энергия гидролиза АТФ сочетается с переносом электронов, как протекает восстановление молекулы азота, не ясен механизм участия в этом процессе железа и молибдена. Потребность в молибдене у азотфиксирующих азотобактера намного больше, чем у нитратредуцирующих видов.

В симбиотической фиксации азота участвуют и другие металлсодержащие ферменты, например, леггемоглобин, который локализуется в растительных клетках. В клубеньках он присутствует в виде продукта симбиоза бактерий и высших растений, но активность азотфиксации зависит от его концентрации в клубеньках.

Функция леггемоглобина сходна с функцией гемоглобина и заключается в обратимом присоединении кислорода. Леггемоглобин — переносчик кислорода, не принимает участия в восстановлении азота, но участвует в процессах образования энергии АТФ, которые протекают с участием кислорода, и одновременно позволяет сохранять анаэробные условия для работы нитрогеназы. Механизм защиты нитрогеназы от кислорода сложен, и леггемоглобин, вероятно, лишь один из звеньев в этом процессе.

Восстановление азота через диимид и гидразин
Схема ступенчатого восстановления азота через диимид и гидразин (Харди, 1970)

У анаэробных азотфиксаторов предположительно есть несколько механизмов защиты нитрогеназы от кислорода. Например, очень высокая дыхательная активность азотобактера является системой защиты от инактивации кислородом.

Другой предполагаемый способ — «конформационная защита нитрогеназы», то есть пространственное изменение белкового компонента нитрогеназы в присутствии кислорода.

В азотфиксации принимают участие корриноиды — соединения группы витамина В12, включающие кобальт. Потребность в кобальте была показана в опытах по симбиотическому выращиванию бобовых на питательных средах, лишенных азота, и установлена по факту положительного действия на активность азотфиксации. В клубеньках корриноиды присутствуют в клубеньковых бактериях (бактероидах) и в растительной ткани клубенька.

Биохимическая роль витамина В12 в азотфиксации мало изучена, известно, что соединения группы В12 входят в состав ферментов метилмалонил-КоА-мутазы и рибонуклеотидредуктазы.

Таблица. Содержание в клубеньках веществ, участвующих в азотфиксации[1]

Вещества
Эффективный штамм
Неэффективный штамм
Витамин B12 в клубеньках люпина, ммкг/г
65
45
Кобамидные коэнзимы в клетках Rhizobium melitoli, тыс. ммоль/г
25,5
6,7
Гемоглобин в клубеньках фасоли (по данным Шемахановой), мг/г сухой массы
95
68
Дезоксирибонуклеиновая кислота в клубеньках люпина, мг/г
0,04
0,016

Производные витамина В12 катализируют биохимические реакции, в которых происходит перенос водорода между двумя смежными атомами углерода с одновременным перемещением других групп в противоположном направлении.

Роль кобамидных коэнзимов в клубеньках бобовых растений
Роль кобамидных коэнзимов в клубеньках бобовых растений

Применение азотфиксации в земледелии

Белок важнейший компонент пищи че­ловека и животных. Во многих странах мира в расчете на единицу площади наблюдается резкий дефицит пищевого белка. Бобовые культуры в расчете на единицу площади позволяют получать белка гораздо больше, чем злаковые. Так, количества белка в семенах люпина и сои в 2-3 раза больше, чем в зерне пшеницы, ржи или овса, и в 3-4 раза больше, чем в зерне риса и кукурузы.

Стоимость белка бобовых в 10 раз ниже белка хлебных злаков, при этом он на 80-90% состоит из легкоусвояемых форм, полноценнее по составу аминокислот.

С агрономической точки зрения, бобовые культуру также имеют большое значением, как культуры, обогащающие пожнивными остатками и накапливающие азот в почве, ускоряют минерализацию растительных остатков, повышают коэффициент использования почвенного азота.

По данным длительного опыта, проведенного в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева Б.А. Доспеховым, на дерново-подзолистой почве введение в севооборот клевера повысило урожайность ржи на 0,75 т/га, и дополнительно при использовании фосфорных и калийных удобрений — на 1,18 т/га. Еще больший эффект был достигнут при применении известкования в дозах 1 т/га на неудобренной почве. Многолетние бобовые культуры способствуют структурообразованию, препятствуют развитию эрозионных процессов, выполняют фитосанитарную функцию. Например, люцерна подавляет возбудителя вертициллезного вилта хлопчатника, поэтому её вводят хлопчатниковые севообороты.

Эффективность максимального использования биологического азота зависит от кислотности почвы, то есть применении известкования, внесения фосфорных, калийных удобрений и некоторых микроудобрений.

При решении практических задач, связанных с азотным питанием, важное место занимает доля биологического азота в балансе питательных веществ. 

Данные о величине симбиотической азотфиксации различны. Например, по данным А.В. Соколова количество фиксированного клевером азота варьирует от 45 до 95%, по данным В.Е. Шевчука, только треть азота фиксируется бобовыми растениями из атмосферы, по данным Е.Н. Мишустина, за год в корневых остатках люцерны накапливается примерно 100 кг/га азота и 50 кг/га у клевера.

Согласно расчетам Н.С. Авдонина, основанных на данных Д.Н. Прянишникова о способности клевер фиксировать 150 кг/га азота в год, люцерны — 250-300 кг/га, величина симбиотического усвоения молекулярного азота может достигать 3 млн т, по расчетам Е.Н. Мишустина — около 3,5 млн т. В масштабе биосферы роль симбиотической азотфиксации невелика, так как на долю бобовых культур приходится около 10% общей площади посевов сельскохозяйственных культур, а в естественных фитоценозах их гораздо меньше.

При благоприятных условиях симбиоза, то есть при рНсол 6-7, обеспеченности фосфором, калием, магнием, бором, молибденом, наличии специфичных вирулентных штаммов клубеньковых бактерий, оптимальной влажности почвы, горох посевной фиксирует до 150 кг/га, бобы кормовые и соя — до 250 кг/га, люпин белый — до 300 кг/га азота, при этом урожайность составляет 30-40 ц/га семян.

Однако в практике обеспечить оптимальные условия удается редко, активность симбиоза ослабляется и фиксируется только 20-60 кг/га азота воздуха при урожайности 12-15 ц/га. Иногда из-за избыточной кислотности почвы, недостатка влаги или питательных веществ фиксации азота не происходит, растения дают низкие урожаи с минимальным содержанием белка.

Данных о поступлении в почву азота с атмосферными осадками также недостаточно. Эта величина варьирует от 2 до 20 кг/га в год. До 90% азота, поступающего с семенами, используется урожаем. С семенами зернобобовых вносится от 8 до 15 кг/га азота, зерновых колосовых — 4-6 кг/га.

Несколько лучше изучены вопросы расходных статей баланса азота. Многочисленными работами ряда авторов показано, что азот удобрений на различных почвах используется на 50-60% в вегетационных опытах и на 40-50% в полевых. Однако при определении коэффициентов использования питательных веществ чрезвычайно важное значение имеет изучение сбалансированного питания растений всеми необходимыми элементами.

По данным В.К. Шильникова и Е.Я. Серова, резервом в мировом масштабе азотфиксации наземных и водных экосистем являются синезеленые водоросли и фитосинтезирующие диазотрофы. Некоторые виды цианобактерий образуют ассоциации с грибами (лишайники), высшими растениями, например, симбиотические ассоциации с водным папоротником Azolla. Эффективность многих аэробных азотфиксирующих микроорганизмов повышается при давлении кислорода менее 2,02 ⋅ 104 Па. Поэтому, в морской и грунтовой воде, в почвах затапливаемых рисовых полей, в горячих источниках могут складываться благоприятные условия для азотфиксации аэробными микроорганизмами.

Филлосфера, то есть поверхность листьев растений также служит нишей несимбиотического гетеротрофного связывания микроорганизмами атмосферного азота. Её вклад в общий баланс азотонакопления оценивается в 13-15%, а способность к азотфиксации филлосферных микроорганизмов — в 55%.

Д.Н. Прянишников уделял большое внимание балансу азота как критерию плодородия почв и урожайности культур. Он был первым, кто подсчитал баланс азота в СССР. В 1937 г. дефицит азота составлял примерно 70%. По его расчетам, в 1940 г. большая часть возвращаемого на угодья азота поступала: с навозом — до 14,8%, с корнями бобовых — 8,2%, с минеральными удобрениями — 3,2%, всего — 26,2%. Остальные 73,8% составлял дефицит.

Изучение процессов микробиологической фиксации азота позволит более эффективно использовать его в земледелии.

К наиболее важным практическим вопросам биологического азота, требующим изучения относятся:

  1. Эколого-биологическое и агрономическое аспекты процесса для полноценного использования и интенсификации азотфиксации.
  2. Изучение механизмов биологического связывания в мягких условиях для разработки новых способов получения азотных удобрений и приемов регулирования процессов азотфиксации.
  3. Генетико-селекционные исследования симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями, а также применение генной инженерии, достижений биохимии и молекулярной биологии для распространения процессов азотфиксации на многие сельскохозяйственные культуры.

Литература

Ягодин Б.А., Жуков Ю.П., Кобзаренко В.И. Агрохимия/Под ред. Б.А. Ягодина. — М.: Колос, 2002. — 584 с.: ил.

Растениеводство/П.П. Вавилов, В.В. Гриценко, В.С. Кузнецов и др.; Под ред. П.П. Вавилова. – 5-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1986. — 512 с.: ил. — (Учебник и учеб. пособия для высш. учеб. заведений).