Азотфиксация

Значение азотфиксации

На долю азота в атмосферном воздухе приходится 78,09%. Над 1 гектаром суши или водной поверхности Земли содержится около 80 тыс. т азота, который недоступен большинству высших растений.

В естественных условиях, когда в почве низкий уровень минерального азота, бобовые растения особенно успешны благодаря своей способности фиксировать атмосферный азот. Ряд других растений, обладающих этой особенностью, например, виды гуннеры (Gunnera), ольхи (Alnus) и казуарина (Casuarina) имеют симбиотические отношения с почвообитающими организмами, которые колонизируют их корни. Симбиоз растений и полезных организмов, как показывают ископаемые данные, было одним из основных факторов успеха распространения растений. Хотя гены, необходимые для сигнализации о начале колонизации корней, были охарактеризованы, происхождение этих генов остаётся невыясненным.

В зависимости от источников энергии азотфиксирующие микроорганизмы относят к: автотрофам и гетеротрофам.

По оценкам, суммарный объём азотфиксации в год в наземных экосистемах составляет 175-190 млн т азота, 90-110 млн т из которых приходятся на почвы сельскохозяйственных угодий.

Бобовые имеют специфические отношения с почвенными бактериями рода Rhizobium, при которых бактерии проникают в корни, что приводит к процессу преобразования атмосферного азота в растворимый. Способность к симбиозу с Rhizobium является одной из основных причин, по которой бобовые характеризуются как «растения-пионеры», поскольку они обычно колонизируют почвы с низким содержанием азота и часто в открытых средах. Культуры, обладающие способностью формировать симбиотические отношения, являются одним из основных источников азота в сельскохозяйственных системах с ограниченными ресурсами.

После уборки урожая, когда большая часть фиксированного азота в виде белка удаляется с поля, остаётся остаточный уровень азота в ботве, корневой системе и узлах. Там, где корни остаются разлагаться в почве, нитрат высвобождается медленно и доступен для поглощения следующей культурой. Эти уровни могут значительно варьироваться, но признано, что они составляют около 20-50 кг N/га.

Этот источник азота является экономически ценным в системе земледелия, так как он обеспечивает источник азота сразу для следующей культуры. Поскольку фиксированный азот высвобождается в почве относительно медленно, риск вымывания во влажные периоды меньше, чем при внесении удобрений, но, что не менее важно, остаточный азот, доступный для следующей культуры, снижает потребность в нём примерно на 50 кг/га. Кроме того, включение бобовой культуры в севооборот обеспечивает «перерыв» в системе, основанной преимущественно на зерновых, уменьшая накопление патогенов зерновых, таких как гриб Gaeumannomyces graminis, и предоставляя возможность борьбы с многолетними сорняками и травами, такими как Лисохвост мышехвостниковидный Alopecurus myosuroides, которая выработала устойчивость к обычно используемым граминицидам. В ЕС было подсчитано, что урожайность озимой пшеницы сразу после бобовой культуры увеличивается на 0,6 и 0,9 т/га.

Интенсивность азотфиксации

Процесс азотфиксации осуществляется свободноживущими в почве анаэробными бактериями Clostridium pasterianum, аэробными Azotobacter croococcum и клубеньковыми, живущими в симбиозе на корневой системе бобовых растений, Rhizobium. На их жизнедеятельность и эффективность азотфиксации влияют обеспеченность углеводами, фосфором, кальцием и другими элементами, реакция почвенной среды, температура, влага.

На эффективность влияет азотный статус почвы. Это особенно очевидно, когда уровень неорганического азота в почве высок и это подавляет естественное образование клубочков и фиксацию азоталюпина приводит к снижению фиксации азота, но в варианте на фоне минерального азота это снижение больше, чем без азота.

Коэффициент азотфиксации составляет от 0,3 до 0,85.

Интенсивность азотфиксации свободноживущими бактериями зависит от запасов легкодоступных органических веществ, служащих источником энергии. Например, активность азотфиксации в прикорневой зоне растений за счёт ассоциативной азотфиксации в 3-200 раз больше, чем в почвах междурядий. Поэтому растения является главным фактором деятельности диазотрофных бактерий в ризосфере благодаря корневой экссудации и корнеопада, объём которых составляет от 25 до 50% продукции фотосинтеза.

Интенсивность фиксации азота диазотрофов определяется выделительной деятельностью корневых систем растений, то есть, в конечном счёте от фотосинтетической активности. Высокая активность в ризосфере многих тропических растений связана со способностью использовать при фотосинтезе путь С-4-дикарбоновых кислот. Растениям этого типа требуют интенсивного освещения, а максимальная скорость фотосинтеза у них значительно выше, чем у растений, использующих цикл Кальвина (С-3-тип). Так как растениями с С-4-типом расходуется меньшее количество углеводов на фотодыхание, их часть используется для роста корней и корневой экссудации.

Несимбиотическая азотфиксация изучалась многими исследователями, однако о её масштабах в различных почвенно-климатических зонах информации мало, в связи с тем, что в природных условиях этот процесс зависит от ряда динамичных факторов среды. Так, согласно ряду исследований плодородных почв рисовых полей показано, что в результате несимбиотической фиксации под рисом накапливаться 60-70 кг/га азота в год. Причём в затопляемых почвах фиксируется 57-63 кг/га азота, а в незатопляемых — 3-7 кг/га, без растений в затопленных почвах — 23-28 кг/га азота.

За 3 месяца вегетации азотфиксация в почвах рисовых полей Краснодарского края составляла 9-27 кг. Внесение соломы в почву способствует размножению различные группы азотфиксирующих бактерий и росту азотфиксации до 20-40 кг/га в месяц. Влажность также способствует усилению активности при разложении соломы и целлюлозы. В интразональных почвах избыточного увлажнения, то есть пойменных, болотных почвах и рисовых плантациях, активность наиболее высока — от 16,5 до 67,5 кг/га в месяц. В почвах тропической зоны несимбиотическая азотфиксация в среднем составляет 200 кг/га в год, достигая иногда 600 кг/га в год.

Активность несимбиотической азотфиксации зависит также от: влажности, температуры, гранулометрического состава почвы, степени аэрированности корнеобитаемого слоя, содержания углекислого газа, наличия макро- и микроэлементов. Минеральные удобрения, известкование, воздушный режим также влияют на интенсивность, но, высокая эффективность отмечается, когда влажность, температура и органическое вещество не лимитируют азотфиксацию. Внесение в дерново-подзолистые почвы растительных остатков позволяет увеличить азотфиксирующую активность в 2-5 раз при условии достаточного увлажнения.

Температура влияет на скорость фиксации азота, а экстремально высокие или низкие температуры снижают эффективность. Фиксация азота у бобовых чувствительна к избытку воды.

Минеральные азотные удобрения оказывают регулирующее действие на азотфиксацию. В опытах in vitro доказано торможение азотфиксации при наличии связанного азота (при отсутствии растений). Торможение отмечается при дозах связанного азота более 500-1000 кг/га. Дозы удобрений, которые используются в земледелии, вызывают кратковременное подавление азотфиксации. В то же время, азотные удобрения стимулируют развитие растений, повышают продуктивность фотосинтеза и увеличивают масштабы экзоосмоса, способствуя тем самым ассоциативной азотфиксации на последующих стадиях развития растения, когда избыток минерального азота удобрений в почве значительно снизится.

Применение радиометрического метода в исследованиях количества органического вещества в пожнивно-корневых остатках позволило выявить, что за счёт корневых выделений в течение вегетации и постоянного отмирания части корневой системы после уборки растений в почве остаётся в 3-4 раза больше органического вещества, чем при определении этого показателя обычными методами. При расчёте органического вещества следует также учитывать прижизненно отмершие надземные органы растений.

В симбиозе с клубеньковыми бактериями бобовые культуры способны удовлетворять до 60-90% своей потребности в азоте. Однолетние зернобобовые культуры, например, люпин, горох, за сезон связывают 50-100 кг/га азота, половина которого остаётся в почве, многолетние бобовые травы (клевер, люцерна) — 180-300 кг/га, из которого с корнями и пожнивными остатками остаётся в почве 70-100 кг/га.

Азотфиксирующие бактерии

Автотрофные азотфиксаторы — цианобактерии и фотосинтезирующие анаэробные бактерии. Имеют значение только в условиях переувлажнения и на затопленных почвах, где фиксация достигает 20-50 кг/га азота в год.

Гетеротрофные азотфиксирующие бактерии распространены на всех типах почв в ризосфере и филлосфере растений. Из этой группы хорошо изучены клубеньковые бактерии и их роль в азотном питании бобовых растений и обогащении почв азотом. Вклад других гетеротрофных симбиотических азотфиксаторов, например, эндосимбионты ольхи, облепихи, ещё плохо изучен.

Несимбиотические гетеротрофные азотфиксирующие бактерии также мало изучены, хотя азотфиксирующая способность микроорганизмов была открыта именно у представителей этой группы. В почвах зоны умеренного климата они связывают до 3-5 кг/га азота в год. Выявлено большое видовое разнообразие и широкое их распространение в почвах всех климатических зон, в ризосфере и на поверхности растений, в водоёмах, илах и осадках, в кишечнике насекомых, рыб и высших животных.

Способность к азотфиксации обнаружена у большого числа бактерий различных систематических групп. Помимо азотобактера, клостридий и клубеньковых бактерий, этой способностью обладают бактерии: Arthrobacter, Bacillus, Erwinia, Klebsiella и др. Чистые культуры эукариотных микроорганизмов, в том числе грибы и дрожжи, не обладают азотфиксирующей активностью, однако смешанные культуры азотфиксаторов с эукариотами отличаются повышенной нитрогеназной активностью. Бактерии группы Azotobacter хорошо развиваются на аэрируемых окультуренных, хорошо прогретых, нейтральных почвах, содержащих фосфор и кальций. При благоприятных условиях накапливает до 30 кг азота на 1 га.

Активная деятельность клубеньковых бактерий определяется розовой или красной окраской клубеньков, при небольшой активности клубеньки имеют белую или бледно-зелёную окраску. Для активизации их деятельности семена зернобобовых культур обрабатывают бактериальными удобрениями, например, ризоторфином или нитрагином.

Клубеньковые бактерии представляют собой палочки, в свободном состоянии — строгие аэробы и не способны усваивать азот воздуха. Установлено несколько видов клубеньковых бактерий, отличающихся по типу отношения к растению-хозяину. Некоторые виды бактерий способны заражать группу бобовых растений, другие очень специфичны и вступают в симбиоз только с отдельными культурами.

Ассоциативная азотфиксация

Ассоциативная азотфиксация — фиксация азота в фитоплане, то есть ризосфере и филлосфере небобовых растений. Впервые, возможность азотфиксации в прикорневой зоне небобовых культур, была предсказана в 1926 г. С. П. Костычевым, впоследствии экспериментально подтверждена исследованиями с использованием балансового метода (Брэдбокский опыт (Англия), опыт Прянишникова, опыт «вечная» рожь (Германии)).

Бессменное выращивание небобовых культур не приводило к значительному снижению содержания азота в почве, несмотря на его ежегодное отчуждение с урожаем, в то же время в пару количество азота непрерывно уменьшалось. При ассоциативной азотфиксации микроорганизмы и растения не вступают в такое взаимодействие, как в симбиотических системах, однако, в целом, имеет те же особенности: активность азотфиксации изменяется по мере развития растений, максимум достигается в периоды бутонизации и цветения, снижается при созревании.

Изначально внимание было уделено взаимодействию азотфиксирующих бактерий (Spirillum spp., Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense и др.) с корневой системой тропических злаковых растений. Однако утверждение об уникальности свойств азоспирилл оказалось преувеличенным. В настоящее время известно о фиксации азота ризосферой риса, кукурузы, сорго, пшеницы, некоторых видов тропических трав. Известно свыше 200 видов небобовых растений, способных к азотфиксации с помощью ризосферных микроорганизмов.

Ассоциативная азотфиксация имеет большую экологическую значимость, именно за счёт неё происходит пополнение фонда доступного азота в большинстве природных экосистем. Однако клубеньковые бактерии (Rhizobium) в симбиозе с бобовыми культурами показывают наибольшую эффективность: в оптимальных условиях биологическая фиксация азота достигает свыше 300 кг/га в год.

Механизм биологического связывания азота

В конце прошлого столетия высказывались разные предположения о механизмах связывания азота. Рассматривали два варианта — окислительный и восстановительный. Д. Н. Прянишников считал, что переход N₂ в NH₃ через оксиды азота невозможен, так как противоречит принципу допустимой экономии энергии организмов. С. Н. Виноградский в конце прошлого века высказал предположение о способе восстановительного связывания молекулярного азота до аммиака.

Гипотетическая схема превращения азота при азотфиксации

Механизм процесса усвоения азота представляется в данном случае как действие водорода в момент его выделения на газообразный азот в живой протоплазме клетки. Гипотеза, что синтез аммиака является непосредственным результатом этого процесса, кажется нам обоснованной.

С. Н. Виноградский Об усвоении микробами газообразного азота атмосферы

П. А. Костычев развил теорию С. Н. Виноградского о восстановительной фиксации молекулярного азота через аммиак. В настоящее время этот механизм считается общепризнанным.

Клубеньковые бактерии (Rhizobiales) стимулируются к заражению через корневые волоски или через трещины в эпидермисе растений-хозяев корневыми экссудатами, содержащими флавоноиды, которые выделяются в почву во время роста корней.

Закрепившись в корнях, бактерии размножаются и перемещаются в кору корня по инфекционной нити, которая представляет собой трубку из стенок клеток. Корни реагируют на эту инфекцию образованием корневых узелков, которые возникают в результате увеличения клеток ткани корня. Перемещение бактерий внутри корней приводит к образованию новых узелков, а по мере старения узелков они отмирают, высвобождая ризобии в почву для инвазии в новые корни. Узелки обеспечивают специализированную нишу, позволяющую ризобиям фиксировать азот в условиях минимального количества воздуха, что защищает фермент нитрогеназу, но позволяет присутствовать достаточному количеству кислорода для аэробного дыхания, связанного с фиксацией азота.

Основным ферментом, отвечающим за азотфиксацию является нитрогеназа. У бобовых культур она сосредоточена в клубеньковых бактериях. Трудности по выделению этого фермента из клеточных организмов, долгое время задерживало изучение биохимических процессов азотфиксации. Выделить нитрогеназу можно только в отсутствии воздуха.

Впервые бесклеточные экстракты из клубеньков сои получены в 1968 г. в лаборатории Эванса. В СССР впервые был выделен ферментный комплекс (нитрогеназа) из бактероидов клубеньков люпина и сои в 1970 г.

Нитрогеназа состоит из двух белковых структур: одна — с молекулярной массой 164 000, содержит молибден и железо, вторая — с молекулярной массой 56 000, содержит только железо. По отдельности эти структуры не фиксируют молекулярный азот.

У большинства микроорганизмов нитрогеназа инактивируется кислородом, причём Fe-белок обладает большей чувствительностью к кислороду, чем Мо-Fe-белок. Fe-белок также очень чувствителен к холоду и инактивируется при температуре 0 °С. Для биохимической реакции восстановления азота необходимо наличие АТФ, источника электронов и ионов Mg²⁺. Большинство учёных считают, что на фиксацию 1 молекулы азота расходуется 15 молекул АТФ.

Отличительная особенность нитрогеназы — способность восстанавливать не только молекулярный азот, но и другие молекулы с тройной связью. Эта особенность позволила использовать метод определения азотфиксации по восстановлению ацетилена (HC≡CH) в этилен (H₂C=CH₂).

Биохимия нитрогеназы до конца не изучена. Например, не известно, как энергия гидролиза АТФ сочетается с переносом электронов, как протекает восстановление молекулы азота, не ясен механизм участия в этом процессе железа и молибдена. Потребность в молибдене у азотфиксирующих азотобактер намного больше, чем у нитратредуцирующих видов.

В симбиотической фиксации азота участвуют и другие металлсодержащие ферменты, например, леггемоглобин, который локализуется в растительных клетках. В клубеньках он присутствует в виде продукта симбиоза бактерий и высших растений, но активность азотфиксации зависит от его концентрации в клубеньках.

Схема ступенчатого восстановления азота через диимид и гидразин при азотфиксации (Харди, 1970)

Нитрогеназа очень чувствительна к кислороду, но ризобии требуют кислорода для дыхания. В узелках содержится высокая концентрация леггемоглобина, который переносит кислород и окружает бактерии в инфицированных узелках. Этот леггемоглобин способен передавать бактериям кислород в низкой концентрации, поэтому его присутствие в узелках необходимо. В анаэробных условиях или в заболоченных почвах скорость фиксации азота сильно снижается, и для эффективной биологической фиксации азота необходим хорошо аэрируемый тип почвы.

Функция леггемоглобина сходна с функцией гемоглобина и заключается в обратимом присоединении кислорода. Леггемоглобин — переносчик кислорода, не принимает участия в восстановлении азота, но участвует в процессах образования энергии АТФ, которые протекают с участием кислорода, и одновременно позволяет сохранять анаэробные условия для работы нитрогеназы. Механизм защиты нитрогеназы от кислорода сложен, и леггемоглобин, вероятно, лишь один из звеньев в этом процессе.

У анаэробных азотфиксаторов предположительно есть несколько механизмов защиты нитрогеназы от кислорода. Например, очень высокая дыхательная активность азотобактера является системой защиты от инактивации кислородом.

Другой предполагаемый способ — «конформационная защита нитрогеназы», то есть пространственное изменение белкового компонента нитрогеназы в присутствии кислорода.

В азотфиксации принимают участие корриноиды — соединения группы витамина B₁₂, включающие кобальт. Потребность в кобальте была показана в опытах по симбиотическому выращиванию бобовых на питательных средах, лишённых азота, и установлена по факту положительного действия на активность азотфиксации. В клубеньках корриноиды присутствуют в клубеньковых бактериях (бактероидах) и в растительной ткани клубенька.

Таблица. Содержание в клубеньках веществ, участвующих в азотфиксации.

Вещества	Эффективный штамм	Неэффективный штамм
Витамин B12 в клубеньках люпина, мкг/г	65	45
Кобамидные коэнзимы в клетках Ensifer meliloti (син. Rhizobium meliloti), тыс. ммоль/г	25,5	6,7
Гемоглобин в клубеньках фасоли (по данным Шемахановой), мг/г сухой массы	95	68
Дезоксирибонуклеиновая кислота в клубеньках люпина, мг/г	0,04	0,016

Биохимическая роль витамина B₁₂ в азотфиксации мало изучена, известно, что соединения группы B₁₂ входят в состав ферментов метилмалонил-КоА-мутазы и рибонуклеотидредуктазы.

Производные витамина B₁₂ катализируют биохимические реакции, в которых происходит перенос водорода между двумя смежными атомами углерода с одновременным перемещением других групп в противоположном направлении.

Роль кобамидных коэнзимов в клубеньках бобовых растений

Применение азотфиксации в земледелии

При решении практических задач, связанных с азотным питанием, важное место занимает доля биологического азота в балансе питательных веществ. Данные о величине симбиотической азотфиксации различны. Например, по данным А. В. Соколова количество фиксированного клевером азота варьирует от 45 до 95%, по данным В. Е. Шевчука, только треть азота фиксируется бобовыми растениями из атмосферы, по данным Е. Н. Мишустина, за год в корневых остатках люцерны накапливается примерно 100 кг/га азота и 50 кг/га у клевера.

Согласно расчётам Н. С. Авдонина, основанных на данных Д. Н. Прянишникова о способности клевер фиксировать 150 кг/га азота в год, люцерны — 250-300 кг/га, величина симбиотического усвоения молекулярного азота может достигать 3 млн т, по расчётам Е. Н. Мишустина — около 3,5 млн т. В масштабе биосферы роль симбиотической азотфиксации невелика, так как на долю бобовых культур приходится около 10% общей площади посевов сельскохозяйственных культур, а в естественных фитоценозах их гораздо меньше.

При благоприятных условиях симбиоза, то есть при pH_сол 6-7, обеспеченности фосфором, калием, магнием, бором, молибденом, наличии специфичных вирулентных штаммов клубеньковых бактерий, оптимальной влажности почвы, горох посевной фиксирует до 150 кг/га, бобы кормовые и соя — до 250 кг/га, люпин белый — до 300 кг/га азота, при этом урожайность составляет 3-4 т/га семян. Однако в практике обеспечить оптимальные условия удаётся редко, активность симбиоза ослабляется и фиксируется только 20-60 кг/га азота воздуха при урожайности 1,2-1,5 т/га. Иногда из-за избыточной кислотности почвы, недостатка влаги или питательных веществ фиксации азота не происходит, растения дают низкие урожаи с минимальным содержанием белка.

Данных о поступлении в почву азота с атмосферными осадками также недостаточно. Эта величина варьирует от 2 до 20 кг/га в год. До 90% азота, поступающего с семенами, используется урожаем. С семенами зернобобовых вносится от 8 до 15 кг/га азота, зерновых колосовых — 4-6 кг/га.

Несколько лучше изучены вопросы расходных статей баланса азота. Многочисленными работами ряда авторов показано, что азот удобрений на различных почвах используется на 50-60% в вегетационных опытах и на 40-50% в полевых. Однако при определении коэффициентов использования питательных веществ чрезвычайно важное значение имеет изучение сбалансированного питания растений всеми необходимыми элементами.

По данным В. К. Шильникова и Е. Я. Серова, резервом в мировом масштабе азотфиксации наземных и водных экосистем являются синезелёные водоросли и фитосинтезирующие диазотрофы. Некоторые виды цианобактерий образуют ассоциации с грибами (лишайники), высшими растениями, например, симбиотические ассоциации с плавающим папоротником азоллы (Azolla spp.). Эффективность многих аэробных азотфиксирующих микроорганизмов повышается при давлении кислорода менее 2,02⋅10⁴ Па. Поэтому, в морской и грунтовой воде, в почвах затапливаемых рисовых полей, в горячих источниках могут складываться благоприятные условия для азотфиксации аэробными микроорганизмами.

Филлосфера, то есть поверхность листьев растений также служит нишей несимбиотического гетеротрофного связывания микроорганизмами атмосферного азота. Её вклад в общий баланс азотонакопления оценивается в 13-15%, а способность к азотфиксации филлосферных микроорганизмов — в 55%.

Д. Н. Прянишников уделял большое внимание балансу азота как критерию плодородия почв и урожайности культур. Он был первым, кто подсчитал баланс азота в СССР. В 1937 г. дефицит азота составлял примерно 70%. По его расчётам, в 1940 г. большая часть возвращаемого на угодья азота поступала: с навозом — до 14,8%, с корнями бобовых — 8,2%, с минеральными удобрениями — 3,2%, всего — 26,2%. Остальные 73,8% составлял дефицит.

Изучение процессов микробиологической фиксации азота позволит более эффективно использовать его в земледелии.

К наиболее важным практическим вопросам биологического азота, требующим изучения относятся:

1. Эколого-биологическое и агрономическое аспекты процесса для полноценного использования и интенсификации азотфиксации.
2. Изучение механизмов биологического связывания в мягких условиях для разработки новых способов получения азотных удобрений и приёмов регулирования процессов азотфиксации.
3. Генетико-селекционные исследования симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями, а также применение генной инженерии, достижений биохимии и молекулярной биологии для распространения процессов азотфиксации на многие сельскохозяйственные культуры.

Литература

• Ягодин Б. А., Жуков Ю. П., Кобзаренко В. И. Агрохимия. / Под ред. Б. А. Ягодина М.: Колос. 2002
• Вавилов П. П., Гриценко В. В., Кузнецов В. С. и др. Растениеводство / Под ред. Вавилова П. П. 5-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат. 1986