Генетика и селекция лука

[toc]

Хромосомы

Внешний вид и поведение хромосом (цитогенетика) у аллиумов были описаны Джонсом (1990). Основное число хромосом для этой группы растений обычно равно восьми, поэтому, за исключением необычных случаев, число хромосом, которые можно увидеть во время деления клеток, кратно восьми. У лука-порея и шнитт-лука иногда встречается от одной до трех дополнительных маленьких «сверхнормативных» хромосом. Восемь основных хромосом лука можно различить по их длине, соотношению двух плеч по обе стороны от центромеры и полосам темного окрашивания, и на этом основании они были пронумерованы от одной до восьми (см. рис.; de Vries, 1990). Это важно для исследований, в ходе которых составляется карта расположения в хромосоме определенных генов.

(a) Хромосомы шалота, Allium cepa, во время деления клетки (митоза) на стадии метафазы c, показывая 16 хромосом, каждая из которых делится на две копии. Масштабная линейка = 10 мкм. (b) Диаграммное изображение хромосом лука, пронумерованных от 1C до 8C в соответствии с согласованной системой наименований (de Vries et al., 1990). Числа вверху - это относительная длина; числа у разрыва каждой хромосомы, который представляет собой положение центромеры, - это процент от общей длины, образующий короткие плечи хромосом. Также показаны 95% доверительные границы для каждой длины или процентной длины. Темные линии на концах, а также внутри некоторых хромосом - это положение полос, выявленных при окрашивании Giemsa (de Vries and Jongerius, 1988).
(a) Хромосомы шалота, Allium cepa, во время деления клетки (митоза) на стадии метафазы c, показывая 16 хромосом, каждая из которых делится на две копии. Масштабная линейка = 10 мкм. (b) Диаграммное изображение хромосом лука, пронумерованных от 1C до 8C в соответствии с согласованной системой наименований (de Vries et al., 1990). Числа вверху - это относительная длина; числа у разрыва каждой хромосомы, который представляет собой положение центромеры, - это процент от общей длины, образующий короткие плечи хромосом. Также показаны 95% доверительные границы для каждой длины или процентной длины. Темные линии на концах, а также внутри некоторых хромосом - это положение полос, выявленных при окрашивании Giemsa (de Vries and Jongerius, 1988).

Считается, что 32 хромосомы лука-порея возникли в результате удвоения исходного набора из 16 хромосом у предкового растения. Такое растение называется «автотетраплоидом». Поскольку у такого растения вдвое больше диплоидного числа хромосом, каждый набор хромосом, вместо того чтобы нести два набора возможных вариантов или «аллелей» для каждого гена диплоида, несет четыре таких аллеля. Это делает изучение генетики, включая определение того, какие варианты или аллели встречаются для каждого гена, более сложным, чем у диплоидов. Хромосомы с числом 32 (тетраплоиды) и иногда 24 (триплоиды) также встречаются у шнитт-лука и ракии, а китайский шнитт-лук обычно тетраплоиден (Havey, 2002).

У лука репчатого сегменты хромосом по всей длине хромосомных плеч могут пересекаться во время мейоза, в то время как у японского пучкового лука точки пересечения ограничены областью вблизи центромеры на каждой хромосоме (Havey, 2002). Такое же ограничение перекреста происходит у лука-порея и приводит к появлению характерных крестообразных узоров на парных хромосомах, наблюдаемых в мейозе. Считается, что локализация перекреста на этом коротком участке хромосом у порея предотвращает объединение более двух хромосом во время мейоза порея (Jones, 1990). В противном случае может произойти ассоциация и перекрест между группами из трех или даже четырех одинаковых хромосом, что помешает нормальному разделению эквивалентных пар хромосом в каждом дочернем ядре на более поздних стадиях мейоза. Такие нарушения обычно приводят к бесплодию. Поэтому такая локализация перекреста у лука-порея, вероятно, сохраняет его способность к образованию фертильной пыльцы и завязей. Неправильности скрещивания в мейозе, приводящие к несбалансированному, нежизнеспособному набору хромосом в половых клетках, являются причиной бесплодия у гибридов между видами Allium, как это часто наблюдалось при скрещивании лука репчатого и лука-батуна.

Лук репчатый часто используется в лабораторном преподавании цитогенетики, поскольку он имеет несколько очень крупных хромосом. Это напрямую отражает его огромное содержание ДНК, которое в 107 раз больше, чем у Arabidopsis thaliana, маленького растения с относительно небольшим количеством ядерной ДНК на клетку и коротким временем генерации от семени к семени, которое по этим причинам стало наиболее интенсивно изучаемым растением «типа» для генетических исследований. Содержание ядерной ДНК в луке почти в четыре раза больше, чем в ячмене, ближайшем неаллиевом растении из группы 11 основных видов сельскохозяйственных культур, отмеченных Хейви (2002). Содержание ДНК в луке эквивалентно примерно 15 х 109 нуклеотидным парам оснований. Было показано, что восемьдесят три процента этой ДНК состоят всего из трех повторяющихся фрагментов ДНК, самый распространенный из которых повторяется около 21600 раз. Геном лука состоит из активных генов, кодирующих белки, расположенных вдоль хромосом среди большого количества повторяющихся последовательностей некодирующей ДНК. Считается, что повторяющаяся ДНК возникла в результате дупликации последовательностей ДНК в хромосомах (Havey, 2002). Большое количество повторяющейся ДНК и, как следствие, большой размер генома коррелируют с медленным ростом и длительным временем генерации (Meagher and Vassiliadis, 2005), что характерно для большинства видов allium, однако исследование, сравнивающее 75 видов allium, не выявило общей корреляции между размером генома и жизненной стратегией в пределах рода (Ohri and Pistrick, 2001).

Системы размножения

Некоторые из съедобных аллиумов размножаются вегетативным способом. Раккио, большеголовый чеснок и, в большинстве случаев, чеснок размножаются из луковиц (зубчиков). Все три вида могут давать соцветия, но семена не закладываются, и соцветия возвращаются к производству луковиц или луковиц на различных стадиях развития, за исключением нескольких недавно обнаруженных фертильных клонов чеснока. Китайский шнитт-лук цветет и производит жизнеспособные семена, но обычно во время формирования завязи хромосомы удваиваются, и в яйцевую клетку попадает полный набор из 32 хромосом материнского растения. Таким образом, не происходит оплодотворения и рекомбинации, и результат генетически эквивалентен вегетативному размножению — это называется апомиксис. Гибридизация происходит примерно в 10% потомства от скрещивания между сортами китайского шнитт-лука (Kojima et al., 1991), поэтому в небольшом проценте случаев может происходить нормальное оплодотворение и обмен генами. Опыление, хотя обычно и не приводит к оплодотворению, необходимо для производства семян, поскольку запасающая ткань эндосперма семян не образуется без опыления (Kojima and Kawaguchi, 1989).

Клоны чеснока, способные производить жизнеспособные семена после нормального мейоза, образования пыльцы и оплодотворения, были обнаружены в центре происхождения этой культуры в Центральной Азии. Отбор из этих клонов привел к улучшению фертильности, урожайности семян и всхожести, а также к уменьшению дефектов рассады (Etoh и Simon, 2002). Используя эти клоны, теперь можно проводить генетические исследования чеснока (Zewdie et al., 2005). Многие сорта шалота также поддерживаются вегетативно, но в последние годы все большее значение приобретают размножаемые семенами сорта, созданные в Израиле и Нидерландах (Rabinowitch and Kamenetsky, 2002).

Несмотря на отсутствие генетической рекомбинации в вегетативно размножаемых культурах, они все еще демонстрируют большое разнообразие между клонами. Например, существуют клоны чеснока, приспособленные для выращивания практически в каждой климатической зоне от Норвегии до экватора. Сорта также различаются по размеру и цвету зубчиков в зависимости от местных предпочтений. Возможности улучшения сельскохозяйственных культур ограничены поддержанием и размножением лучших клонов вегетативным способом (Messiaen et al., 1993). Случайные генетические изменения можно получить, вызывая мутации в культуре тканей и выращивая полученные проростки (Novak, 1990). Хотя это и не является генетическим улучшением, значительного повышения жизнеспособности можно добиться путем удаления вирусов из этих культур.

Лук репчатый, лук-батун, лук-порей и шнитт-лук дают фертильные цветки и обычно преимущественно опыляются перекрестно. Однако эти растения вполне способны к самоопылению. У всех этих видов пыльники отдельных цветков созревают и сбрасывают пыльцу до того, как рыльца становятся полностью восприимчивыми — это называется протандрией (Currah, 1990). У диких аллиумов, имеющих всего несколько цветков на цветочную головку, это, вероятно, является эффективным барьером для самоопыления. Однако у овощных видов может быть до 1000 отдельных цветков в зонтике, и, поскольку раскрытие разных цветков может растянуться на 2-4 недели, пыльце легко оплодотворить восприимчивое рыльце более развитого цветка на той же цветочной головке. Поэтому протандрия является лишь частичным барьером для самоопыления. Обычно 75-90% семян образуются в результате перекрестного опыления на семенных полях лука, а порей обычно опыляется более чем на 80%. В определенных условиях, например, в сетчатых клетках, используемых селекционерами для изоляции растений от бродячих насекомых, переносящих нежелательную пыльцу, степень перекрестного опыления может снизиться до 23-56%, поскольку пчелы и мухи в таких условиях менее активны.

У всех этих видов жизнеспособность и выживаемость проростков, полученных от самоопыления (так называемых «селфов»), гораздо ниже, чем от перекрестного опыления. В одном исследовании 75% скрещенных семян лука выжили и дали луковицы после полевого посева, тогда как менее 50% самоопыленных семян сделали это (Currah and Ockenden, 1983). Это проявление «инбридинговой депрессии», характерной для перекрестно опыляемых или «аутбридинговых» видов растений. При сравнении лука, выведенного путем самоопыления в одном поколении с обычными открыто опыляемыми популяциями, средняя урожайность луковиц нескольких инбредных сортов составила всего 64% от урожайности открыто опыляемых популяций, средняя дата созревания задержалась на 12 дней, а количество толстошеих луковиц увеличилось с 2 до 12% (Dowker and Fennell, 1981). После трех поколений самоопыления лука выживаемость растений может достигать 50%, а низкая жизнеспособность приводит к тому, что только 70% выживших растений способны производить семена (Jones and Mann, 1963). В опыте с луком-пореем средний вес растений снизился на 35% при одном поколении инбридинга и на 60% при двух поколениях самоопыления (Pink, 1992). Из-за такой сильной инбридинговой депрессии семена, полученные полностью от перекрестного опыления, имеют более высокий потенциал выживаемости и урожайности, чем семена от открытого опыления, в которых всегда присутствует доля самоопыления. Одним из преимуществ использования гибридных сортов является то, что они гарантируют, что все посеянные семена получены от перекрестного опыления.

Генетика

По сравнению со многими видами сельскохозяйственных культур у лука репчатого описано лишь небольшое количество «качественных» генов с легко заметными эффектами. Одним из примеров является рецессивный ген, который в гомозиготном состоянии приводит к образованию карликовых семенных побегов. В гетерозиготном состоянии цветоносы имеют нормальную длину, поскольку аллель нормальной длины доминирует над аллелью карликовости. Генетический анализ лука занимает много времени из-за двухлетнего периода генерации и сильной инбридинговой депрессии, что создает трудность в образовании и поддержании большого количества почти гомозиготных инбредных линий, идеальных для анализа генетической связи. Кинг и др. (1998) заявили, что для лука было описано всего 17 морфологических или устойчивых к болезням генных локусов, включая локусы для: цвета луковиц, листвы, пыльников и семенной кожуры; восстановления мужской фертильности при цитоплазматической мужской эстерильности; устойчивости к розовому корню; устойчивости к повреждению озоном; карликовой семенной ножке; и четыре локуса, делетарных для хлорофилла.

Цвет кожицы лука определяется совместным действием ряда основных генов, каждый из которых имеет различные аллели, вызывающие вполне определенные качественные эффекты (El-Shafie and Davis, 1967). Это хороший пример «эпистаза», важного генетического явления, когда взаимодействие нескольких различных генов определяет результат, в данном случае то, какая у луковицы белая, желтая или красная кожица. Многие из этих эпистатических эффектов теперь объяснены с молекулярной точки зрения. Они представляют собой элегантные примеры того, как изменения в хромосомных последовательностях ДНК приводят к модификации контроля генов, синтеза ферментов или функции ферментов, что изменяет биосинтетический путь и, таким образом, полученное растение («фенотип»). Пять основных генов, влияющих на цвет луковицы, были обнаружены в ходе классических исследований генетического наследования. Взаимодействие между этими генами предполагает, что они действуют последовательно на пути биосинтеза антоциановых пигментов (рис.; Kim et al., 2004b, 2005a).

Путь биосинтеза антоциановых пигментов в луке показывает, как аллели генов, определяющих цвет кожи, действуют на уровне ферментов, чтобы определить, какие пигменты производятся
Путь биосинтеза антоциановых пигментов в луке показывает, как аллели генов, определяющих цвет кожи, действуют на уровне ферментов, чтобы определить, какие пигменты производятся. Ферменты сокращенно обозначены следующим образом: CHS - халькон-синтаза; CHI - халькон-изомераза; F3H - флаванон 3-гидроксилаза; F3'H - флавоноид 3-гидроксилаза; DFR - дигидрофлавонол-4-редуктаза; ANS - антоцианидин-синтаза; FLS - флавонол-синтаза; UFGT - UDP глюкозо-флавоноид 3-о-глюкозилтрансфераза (Kim et al., 2004b.).

Во-первых, этот путь зависит от основного цветового фактора или гена C, который имеет как доминантные, так и рецессивные аллели. У белокожих луков отсутствует фермент халькон-синтаза (CHS), поэтому они не производят никаких пигментов антоцианового пути. Ген C, по-видимому, является регуляторным геном, который контролирует, действительно ли гены, кодирующие два фермента CHS, транскрибируются и запускают процесс синтеза белков фермента (Kim et al., 2005b). Желтый лук из США имеет делецию в ДНК гена, транскрибирующего фермент дигидрофлавонол-4-редуктазу (DFR). Эта мутация предотвращает производство DFR и, следовательно, блокирует путь после дигидрокверцетина, что приводит к накоплению желтого пигмента кверцетина без красного цианидина.
Бразильский желтый лук производит DFR, а также белок синтазу антоцианидинов (ANS), но точечная нуклеотидная мутация в последовательности ДНК, кодирующей ANS, приводит к замене аминокислоты глицин на аргинин в соответствующей точке аминокислотной последовательности фермента.

Замена аргинина находится вблизи активного сайта связывания в ферменте, что, вероятно, вызывает его инактивацию, блокируя синтез антоцианидинов (Kim et al., 2005a). Скрещивание американского и бразильского желтого лука приводит к появлению красного лука, поскольку некоторые потомки наследуют аллели, продуцирующие нормальный DFR от бразильского родителя, а также аллели для функционирования ANS от американского родителя, что позволяет функционировать биосинтетическому пути к цианидину. Это объясняет давно известный «эффект дополнительного гена», когда взаимодействие двух генных локусов может привести к появлению краснокожего потомства от скрещивания двух желтокожих родителей (El Shafie and Davis, 1967).

Другой вариант гена, обнаруженный в некоторых необычных луках золотистого цвета, связан с небольшим изменением ДНК, которое привело к производству неактивной халькон-изомеразы (CHI). Последующий блок биосинтеза флавоноидов привел к накоплению ярко-желтого пигмента халькона. Другой аллель продуцирует низкий уровень ANS, что приводит к меньшей выработке цианидина и к появлению розовых, а не красных луковиц. Считается, что это результат изменений в регуляторной последовательности ДНК, примыкающей к последовательности, фактически кодирующей белок ANS (Kim et al., 2005a).

Влияние качественных генов с дискретными основными эффектами часто усиливается или ослабляется рядом мелких генов-модификаторов с количественным влиянием. Это относится к основному гену длины стебля семян, описанному выше, а также к гену, обеспечивающему устойчивость к розовой болезни корней у лука. Двадцать качественных генов, идентифицированных у съедобных аллиумов, были перечислены Рабиновичем (1988). В последние годы, с применением молекулярной генетики к аллиуму, генные локусы идентифицируются все быстрее. К ним относятся генетические локусы для ферментов, влияющих на цвет луковицы, о которых говорилось выше, для нескольких ферментов метаболизма серы, участвующих в синтезе ароматических соединений, и для ключевого фермента в биосинтезе фруктовых веществ (McCallum et al., 2005a, b, 2006). Определены последовательности ДНК генов, кодирующих некоторые из этих ферментов, и эта информация помогает прояснить структуру и функцию ферментов (Shaw et al., 2005). Генетический локус для устойчивости к мучнистой росе был идентифицирован у диких видов аллиума и в настоящее время вводится в лук. Сигё и его коллеги сообщили о генетических локусах для десяти ферментов углеводного и аминокислотного обмена, используя различные варианты ферментов (изоферменты) для генетического анализа и определения того, на какой хромосоме находятся локусы (Shigyo et al., 1996; van Heusden et al., 2000a).

В дополнение к идентификации генов для отдельных дискретных признаков или ферментов, группы генов или полигенные регионы, контролирующие различные аспекты биохимии, были расположены на определенных хромосомах или в регионах генетического сцепления. К ним относятся регионы, кодирующие фруктовые вещества (Havey et al., 2004), ароматические соединения (Galmarini et al., 2001), содержание сахара в листьях (Tran Thi Minh Hang et al., 2004), флавоноиды и антоцианы в листовых влагалищах и некоторые ферменты, участвующие в их синтезе (Shigyo et al., 1997; Masuzaki et al., 2006). Кроме того, существует 2608 опубликованных последовательностей ДНК из лука, которые экспрессируются в виде РНК в корнях, побегах или каллусе и которые имеют соответствия с генами с известной функцией в других организмах (Kuhl, et al., 2004).

Большинство признаков, включая большинство признаков, важных для продуктивности сельскохозяйственных культур, контролируются совместным действием ряда генов, влияющих на признак, каждый из которых оказывает сходное, небольшое, «количественное» влияние. Например, урожайность, срок созревания и легкость созревания колоса обусловлены аддитивным влиянием нескольких генов. Таким образом, скрещивание между экстремальными типами по срокам созревания дает гибриды, промежуточные по отношению к родителям, но из них в последующих поколениях выводится непрерывный диапазон, а не несколько отдельных классов сроков созревания. Целью селекции является объединение в комплементе генов, или «генотипе» сорта, аллелей, благоприятных для желаемых количественных признаков. Например, генотип должен содержать все благоприятные аллели для генов, определяющих высокую урожайность, либо гомозиготно, либо, если эти аллели доминируют над комплементарными аллелями, обуславливающими более низкую урожайность, то присутствие благоприятного доминанта в качестве гетерозиготы одинаково хорошо.

В популяциях лука существует высокий уровень гетерозиготности, поддерживаемый поколениями случайного ауткроссинга. Это позволяет нежелательным рецессивным аллелям сохраняться в генетическом пуле. Самоопыление приводит к гомозиготности для высокой доли этих рецессивных аллелей, тем самым проявляя их действие и вызывая инбридинговую депрессию, описанную выше. Среди пагубных рецессивных аллелей выделяются те, которые вызывают дефицит хлорофилла. В одном исследовании 20-30% растений были гетерозиготны по рецессивному аллелю дефицита хлорофилла, и, по оценкам, в популяциях лука присутствует около 20 таких генных локусов (Berninger and Buret, 1967).

Поскольку лук-порей является тетраплоидом и, следовательно, несет четыре аллеля для каждого гена, существует еще больше возможностей для носительства пагубных рецессивных аллелей в гетерозиготных генотипах, чем у диплоидов, таких как лук. У лука-порея было обнаружено от 7 до 14 различных генов дефицита хлорофилла, и, по оценкам, в открытой опыляемой популяции более 60% растений несли две копии аллелей дефицита одного или нескольких таких генов (Berninger and Buret, 1967). Лук-порей подвержен сильной инбридинговой депрессии.

Генетические карты сцепления

После скрещивания двух родителей, несущих контрастные аллели по ряду генных локусов, можно проследить наследование аллелей каждого локуса в последующих поколениях. Если два признака, обусловленные двумя различными генетическими локусами, наследуются независимо, то говорят, что они «несцеплены», и можно предположить, что генные локусы расположены на разных хромосомах. Если же, напротив, наследование двух характеристик показывает определенную корреляцию, а не просто случайную связь, их генные локусы считаются «сцепленными», и обычно можно предположить, что они находятся на одной хромосоме. Степень, в которой две характеристики наследуются вместе, другими словами, силу сцепления, можно оценить количественно. Можно предположить, что признаки, которые редко рекомбинируют, контролируются генами, расположенными очень близко друг к другу на одной хромосоме, так что их аллели редко переходят друг в друга в результате скрещивания во время мейоза.

Количественно оценив частоту рекомбинации между сцепленными генными локусами по ряду характеристик, можно упорядочить силу связей между ними и построить «карту связей», показывающую их взаимное расположение вдоль хромосомы (рис.). Хромосомы — это физическая реальность, лежащая в основе карты связей, полученной на основе статистики наследования. Отдельные «группы связей» характеристик, которые наследуются вместе, каждая из которых соответствует отдельной хромосоме, должны быть результатом карты связей, основанной на многих характеристиках. Независимое наследование признаков, определяемых генами в разных группах сцепления, отражает случайный набор двух сегрегантов из каждой хромосомы, попадающих в каждую дочернюю клетку во время мейоза. В настоящее время значительные исследовательские усилия направлены на составление генетических карт сцепления для съедобных видов аллиума, в частности лука, как описано в McCallum (2007) и Havey et al.

Генетические карты аллиумов. (a) Карта сцепления хромосомы 4 A. cepa (шалот). Длинные кодовые названия относятся к ДНК-маркерам типа полиморфизма длины амплифицированного фрагмента (AFLP), который использовался для построения карты. Расположение генов, кодирующих ферменты аллииназу, малатдегидрогеназу (MDH) и фосфоглюкомутазу (PGM), показано на карте (van Heusden et al., 2000b). (b) Интегрированная физическая и рекомбинационная карта хромосомы 8 A. fistulosum. Карта сцепления AFLP-маркеров находится справа, а физическое расположение маркеров вдоль хромосомы показано слева в процентах от общей длины хромосомы (Khrustaleva et al., 2005. Courtesy of Genetics).

Первые генетические карты были основаны на наследовании легко наблюдаемых характеристик, но для аллиумов их известно относительно немного. Более того, некоторые из наблюдаемых характеристик, например, устойчивость к болезням, требуют значительных усилий для оценки. В настоящее время генетические карты основываются главным образом на молекулярных «маркерах», которые можно найти в большом количестве и которые можно быстро обнаружить с помощью методов молекулярной биологии. Одним из полезных результатов такой работы является то, что наследование в селекционных линиях растений важных свойств, оценка которых требует больших усилий — например, устойчивости к болезням или генов Ms для восстановления фертильности (см. ниже; Gokce et al., 2002) — можно легко отслеживать с помощью молекулярных маркеров, тесно связанных с желаемым признаком, для быстрого и дешевого обнаружения его наличия или отсутствия у отдельных растений в селекционной программе. Часто такие тесты можно проводить на стадии рассады, так что выращивать нужно только особи, сохранившие аллели желаемого признака. Это называется «селекция с помощью маркеров». Молекулярные маркеры, используемые в генетическом картировании аллиумов, были описаны Клаасом и Фризеном (2002). Вкратце, молекулярные маркеры делятся на изоферменты и методы на основе ДНК. Изоферменты — это аллельные варианты определенных ферментов, которые можно различать и отслеживать при изучении наследственности (Shigyo et al., 1996).

Методы, основанные на ДНК, делятся на несколько подкатегорий. Во-первых, существуют методы, основанные на различиях в размерах фрагментов ДНК. Они образуются путем воздействия на ДНК последовательности расщепляющих ферментов. Генотипы могут различаться по результирующему размеру фрагментов ДНК из определенной точки хромосомы, и наследование этих различий в размерах фрагментов может быть прослежено. Во-вторых, существуют методы, основанные на различиях в последовательности ДНК, которые варьируются между генотипами. Например, могут быть повторы последовательности, пропуски нуклеотидов или замены нуклеотидов. Эти молекулярные варианты, которые проявляются как различия в ДНК в одном и том же месте вдоль гомологичных хромосом, называются полиморфизмами. Наследование различных вариантов внутри полиморфизма можно проследить, так же как и наследование различных аллелей для контрастных форм видимого признака, например, длинных или коротких цветочных стеблей.

Первая карта сцепления лука была основана на ДНК-полиморфизмах и насчитывает 114 локусов, расположенных в 12 группах сцепления (King et al., 1998). Она была получена путем изучения наследования ДНК-маркеров в 58 семьях третьего поколения контролируемых скрещиваний и самосевов, полученных от оригинального скрещивания между инбредной линией из низкоострого, малорастворимого твердого сорта ‘Ailsa Craig’ и инбредной линией из более высокоострого и растворимого твердого сорта ‘Brigham Yellow Globe’. Аллели восстановления мужской фертильности, комплементарный ген красного цвета луковицы и фермент, кодирующий аллииназу, были расположены на карте сцепления и связаны с соседними ДНК-маркерами. Последующий анализ этого кросса проследил наследование ДНК-маркеров параллельно с различиями в содержании сахара и фруктозы, полученными от родительских линий. Результаты показали, что участки хромосом в группах сцепления A, D и E связаны с контролем содержания фруктозы (Havey et al., 2004).

Другая генетическая карта, основанная на скрещивании лука с диким видом A. roylei, позволила разделить 262 ДНК-маркера генома лука на восемь групп сцепления (van Heusden et al., 2000b). На этой карте были обнаружены ген аллииназы и местоположение гена устойчивости к заболеванию пуховой росой, полученного от A. roylei. Группы связей в этой карте были позже отнесены к отдельным физическим хромосомам A. cepa (см. рис. выше a); van Heusden et al., 2000a). Для этого были использованы молекулярные маркеры A. cepa, которые можно было найти в карте сцепления A. cepa x A. roylei, а также в хромосомах, полученных от A. cepa в наборе из восьми линий лука пучкового, A. fistulosum, каждая из которых содержала дополнительную хромосому, отличную от шалота (A. cepa) (Shigyo et al., 1996). Эти линии, названные «моносомными линиями сложения», являются ключом к переводу карты сцепления в «физическую карту», расположенную на восьми хромосомах A. cepa. Анализ биохимических эффектов различных моносомных добавок показал, что группа для биосинтеза флавоноидов и антоцианов находится на хромосоме 5А (Shigyo et al., 1997), а гены для производства сахаров в листьях на хромосомах 2А и 8А (Tran Thi Minh Hang et al., 2004).

Дальнейшим усовершенствованием стало сравнение «генетических расстояний» между ДНК-маркерами — как показано на картах сцепления — с физическими расстояниями между маркерами вдоль хромосом путем прямой визуализации и измерения положения мейотических перекрестов с использованием усовершенствованной техники окрашивания параллельно с картированием рекомбинации маркеров (Khrustaleva et al., 2005). Частота рекомбинации варьировала в различных регионах вдоль хромосомы, указывая на то, что «генетические расстояния» между маркерами соответствуют переменным физическим расстояниям вдоль хромосомы. Характер изменения частоты рекомбинации отличался от того, который был обнаружен для зерновых культур.

Для лука были разработаны маркеры повторов последовательностей ДНК, которые могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (McCallum et al., 2005b). Полиморфизмы для этих маркеров были обнаружены как между селекционными линиями лука, так и внутри них. Карты связей лука, полученные от скрещивания разных исходных родителей, были выровнены с помощью маркеров этого типа, чтобы найти общие точки на обеих картах (McCallum et al., 2005b). Были созданы новые семейства инбредных линий от скрещивания родителей с контрастными свойствами, чтобы эти маркеры можно было использовать для картирования генов, лежащих в основе этих контрастов. Семьи с большим количеством линий, чем 60 или около того, созданных до сих пор, необходимы для более тонкомасштабного картирования с целью выявления более тесно связанных генетических эффектов (McCallum et al., 2005b). Выведение фертильного по мужской линии чеснока, выращенного из семян, позволило составить первую генетическую карту связей для чеснока (Zewdie et al., 2005). Используемые генетические маркеры были разработаны на основе экспрессированных последовательностей ДНК из лука (Kuhl et al., 2004). На карте сцепления был обнаружен локус гена для производства фертильных семян.

Молекулярные маркеры полезны для изучения генетического разнообразия как внутри видов аллиума, так и между ними (Klaas and Friesen, 2002; McCallum et al., 2005b). Маркеры уже находят практическое применение в луковой промышленности; например, маркеры хлоропластной ДНК, характерные для мужской стерильной цитоплазмы, широко используются для быстрой классификации цитоплазмы при выведении поддерживающих и мужских стерильных линий в процессе селекции гибридов лука и для контроля качества (т.е. подтверждения генетической идентичности) в селекции и производстве семян гибридов лука (Havey, 2002; Jakse et al., 2005).

Геномика

Сбор последовательностей ДНК, а для некоторых организмов — секвенирование всего генетического материала, сделал возможным сравнение последовательностей ДНК внутри таксономических групп и между ними (Havey et al.). Функция последовательности ДНК может быть предварительно определена на основе знаний о том, какой фермент или другой белок она или подобные последовательности кодируют у других видов. Таксономические группы, демонстрирующие высокое сходство в расположении последовательностей ДНК вдоль хромосом, как говорят, демонстрируют высокую синтению или колинеарность.

Изучение геномов с целью выяснения того, как они функционируют как единая система, контролируя рост, развитие и адаптацию, а также для выяснения филогенетических отношений между видами, является центральной задачей современных биологических исследований. Такие геномные исследования у аллиумов находятся в зачаточном состоянии, но уже создана библиотека из 11 008 последовательностей ДНК, полученных путем секвенирования ДНК, комплементарной РНК, выделенной из луковицы, корня, листьев и каллусной ткани лука (Kuhl et al., 2004). Информация о последовательностях находится в свободном доступе (ссылка).

Поскольку они получены из РНК, найденной в тканях, это последовательности ДНК, которые активно транскрибируются для РНК, и поэтому они называются «экспрессируемыми метками последовательности» (EST). Они должны охватывать активные гены в соответствующих тканях. Шестьдесят процентов этих последовательностей совпадают с белками из других организмов, из которых почти 24% могут быть предварительно отнесены к какой-либо функциональности генов, в основном связанных с метаболизмом. EST-маркеры, демонстрирующие сходство с EST-маркерами из риса, были отобраны и сопоставлены с линиями, полученными от кросса ‘Ailsa Craig’ х ‘Brigham Yellow Globe’, упомянутого выше в разделе «Карты связей». Физическое расположение этих маркеров на хромосоме было определено с помощью моносомических линий сложения, также упомянутых выше. Сравнение порядка расположения этих EST в луке с порядком, известным для риса, показало малое сходство (т.е. незначительную коллинеарность). Эти результаты позволяют предположить, что геномная информация, полученная от культур семейства травянистых (порядок Poales), которой существует огромное количество, может не обеспечить подходящие геномные модели для культур порядка Asparagales — например, аллиумов (Martin et al., 2005).

Это делает необходимым разработку большего объема геномной информации для этих растений. Учитывая большой геном и длительное время генерации лука и других овощных аллиумов, в качестве «модели» для разработки подробной генетической карты, применимой к этому порядку, скорее всего, будет выбран вид из Asparagales с меньшим геномом и коротким жизненным циклом. Ожидаемая большая степень коллинеарности генов между геномами различных видов в пределах порядка облегчит применение геномной информации от такого «модельного» вида к культурным видам. По мере публикации информации о генетических последовательностях аллиума исследовательскими группами по всему миру, она собирается на вышеуказанном веб-сайте, чтобы геномная информация накапливалась скоординированным и совместным образом (Havey et al.).

Сила гибридов

Скрещивание между сильно различающимися популяциями лука может привести к получению гибридов, превосходящих одного из родителей по силе роста. Например, Синневаг (1988) скрестил финский многозачатковый лук с норвежским крупнолуковичным сортом и получил гибриды, которые превосходили по урожайности обоих родителей, но имели более короткий вегетационный период, чем крупнолуковичный родитель. Такой эффект называется «гибридной силой» или «гетерозисом». В таких гибридах влияние любых неблагоприятных рецессивных аллелей, гомозиготных в родительских линиях, может маскироваться более благоприятными доминантными аллелями другого родителя. При скрещивании нескольких родительских линий, даже если они сами по себе слабые и инбредные, некоторые из полученных гибридов могут быть чрезвычайно энергичными и даже превосходить по продуктивности энергичную перекрестноопыляемую линию. Закрепление генотипов, демонстрирующих такую гибридную энергичность, в гибридных сортах F1 стало доминирующей тенденцией в селекции лука в последние годы. Такие гибриды также были выведены у японского пучкового лука, шнитт-лука и лука-порея. С коммерческой точки зрения одним из преимуществ гибридов F1 является то, что они не размножаются из сохраненных семян, а должны производиться заново каждое поколение от соответствующих родительских линий, которые остаются под контролем селекционера или семенной компании.

Генетическая мужская стерильность и гибридная селекция

Наиболее важными качественными генами у съедобных аллиумов являются те, которые вызывают мужскую стерильность. У растений с мужской стерильностью пыльца не развивается, поэтому они не способны к самоопылению. Следовательно, любое произведенное семя должно быть результатом перекрестного опыления. Это свойство было использовано для получения гибридных сортов F1, демонстрирующих гибридную жизнеспособность, отсюда и важность этих генов для селекции растений. В отсутствие мужской стерильности контролируемое перекрестное опыление без самоопыления может быть достигнуто только путем трудоемкого удаления созревающих пыльников из головки цветка до того, как они сбросят пыльцу, и последующего переноса желаемой перекрестной пыльцы на рыльца вручную. Такая процедура слишком трудоемка для проведения лишь нескольких контролируемых скрещиваний в селекционной или экспериментальной работе.

В луке мужская стерильность была впервые использована Джонсом и Кларком с помощью мужской стерильной особи сорта ‘Italian Red’, которую они нашли на селекционных участках в Дэвисе, Калифорния, в 1925 году. К счастью, когда это растение предотвратили от перекрестного опыления, в головке цветка образовались бульбочки, и его можно было размножить. Джонс и Кларк (1943) опубликовали классическую работу, в которой описали генетику мужской стерильности и указали, как ее можно использовать для получения гибридных сортов. На основе этих методов, первоначально разработанных для лука, мужская стерильность была использована в гибридной селекции ряда других важных культур.

Было показано, что мужская стерильность у лука зависит от совместного воздействия ядерного (т.е. хромосомного) гена и цитоплазматического фактора. Ядерный ген имеет две формы, доминантную форму Ms, которая, когда присутствует, всегда приводит к фертильной пыльце, и рецессивную форму ms, которая, если гомозиготна, может привести к стерильной пыльце. Гомозиготные генотипы ms вызывают мужскую стерильность только в сочетании с цитоплазматическим фактором стерильности S. Цитоплазма яйцевой клетки может нести фактор S, что позволяет генотипам msms экспрессироваться как стерильные, или она может нести фактор N, что всегда приводит к получению растения с фертильной пыльцой, независимо от содержания аллелей ms и Ms в его ядерных генах.

В диплоидном луке могут существовать три генотипа для гена мужской стерильности: MsMs, Msms и msms. Каждый из этих генотипов может встречаться в цитоплазме, несущей либо фактор N, либо фактор S. Единственной комбинацией, приводящей к мужской стерильности, является Smsms. Цитоплазматический фактор (S) передается только через женского (пестичного) родителя в скрещивании — он не может быть передан пыльцой.

Второй источник цитопазматической мужской стерильности (ЦМС), называемый Т-цитоплазмой, был открыт во Франции и в настоящее время используется для получения некоторых европейских и японских гибридов лука. Растения с цитоплазмой Т фертильны, если они имеют доминантный аллель A, восстанавливающий фертильность, или оба доминантных аллеля C и D для двух комплементарных генов, которые действуют вместе для восстановления фертильности (Havey, 2002). Совсем недавно цитоплазматическая мужская стерильность была введена в лук путем скрещивания с диким видом A. galanthum. Фертильность может быть восстановлена доминантным аллелем в одном генном локусе, и было показано, что это не тот же ген-восстановитель, что и для ЦМС типа S, о котором говорилось выше (Havey, 2002; Kik, 2002). Эти альтернативы позволят избежать зависимости от одного генетического источника ЦМС в селекции гибридного лука. Это снижает риск возникновения восприимчивости к болезням, связанной с ЦМС, у всех гибридов, как это произошло в случае с южным поражением кукурузы у гибридной кукурузы в 1960-х годах.

Растения с S-цитоплазмой, вызывающей мужскую стерильность, и N-цитоплазмой, восстанавливающей фертильность, можно отличить с помощью различных молекулярных маркеров из ДНК в их хлоропластах (Havey, 2002). Один из них — способность амплифицировать участок хлоропластной ДНК, специфичный для N-цитоплазмы, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими олигонуклеотидными праймерами — был разработан в качестве быстрого теста для отличия N- от S-типа цитоплазмы. Для определения типа цитоплазмы растения путем обычного скрещивания потребовалось бы 4-8 лет. Теперь эти олигонуклеотидные праймеры быстро и дешево используются для классификации цитоплазмы для линий селекции с поддержкой и мужской стерильностью. Они также используются для контроля качества гибридных семян лука, все из которых должны иметь цитоплазму S-типа (Havey, 2002).

Аналогичные системы мужской стерильности, обусловленные сочетанием цитоплазматического фактора и основного генного фактора, были обнаружены у японского пучкового лука и шнитт-лука (Havey, 2002); у обеих этих культур эта система была использована для выведения гибридных сортов. Было показано, что у шнитт-лука цитоплазматический фактор стерильности переносится митохондриями. У лука-порея были найдены гены мужской стерильности, но цитоплазматический фактор мужской стерильности не был идентифицирован. ЦМС типа Т лука был перенесен в лук-порей в экспериментальных гибридах между этими двумя видами, и наблюдался нормальный, энергичный рост потомства с цитоплазмой Т лука и хромосомами лука-порея, при условии, что хромосома 1С из лука также присутствовала (Peterka et al., 2005). Энергичная мужская стерильная линия, которая легко размножалась из луковиц, сформированных в зонтике, была скрещена с несколькими сортами лука-порея для получения высокоурожайных гибридов (Smith and Crowther, 1995). Изменчивость массы растений у этих гибридов была примерно в два раза меньше, чем у родительских сортов, в основном потому, что слабые самоплодные сеянцы не могут появиться. Популярность гибридов F1 этого типа растет благодаря их улучшенной однородности и более высокой урожайности (de Clercq and van Bockstaele, 2002).

Селекция лука

Съедобные культуры аллиум традиционно делятся на две группы в отношении селекции и отбора новых сортов. Основная группа, в которую входят лук репчатый, лук-порей, лук-батун и шнитт-лук, состоит из фертильных видов, которые нормально производят семена. Вторая группа, в которую входят чеснок, раккио, большеголовый чеснок и различные культуры, полученные от скрещивания Allium cepa и A. fistulosum, редко производят фертильные семена и размножаются вегетативно. Китайский шнитт-лук дает семена, но часто нормальный мейоз не происходит, и семена генетически идентичны материнскому растению; однако существуют и фертильные виды, которые использовались для выведения новых сортов.

Методы традиционной селекции растений, включающие многократные циклы гибридизации между донорской (мужской) пыльцой и женскими родительскими линиями с последующим отбором и скрещиванием потомства от таких скрещиваний, применимы только к фертильным видам. Открытие и использование плодородного чеснока начало менять ситуацию с этой культурой, и в настоящее время ведутся работы по скрещиванию и производству семян (Etoh and Simon, 2002; Zewdie et al., 2005). Более того, методы генетической трансформации и гибридизации соматических клеток теперь позволяют переносить новые гены в вегетативно размножаемые виды.

Исследования по генетике и геномике аллиумов рассмотрены в нескольких главах книги Rabinowitch and Currah (2002). Селекция и генетика лука была рассмотрена Пайком (1986) и Даукером (1990). Селекция лука-порея была рассмотрена Куррахом (1986), Пинком (1992) и де Клерком и ван Бокстаэлем (2002). Аспекты селекции японского лука обобщены Инденом и Асахирой (1990), а селекция сив — Поулсеном (1990). Биология опыления была рассмотрена Куррахом (1990). В этих обзорах даны более полные ссылки на оригинальные исследовательские отчеты.

Селекция съедобных аллиумов была относительно несложной по сравнению со многими важными культурами из-за сравнительного недостатка фундаментальной генетической и молекулярно-генетической информации. В настоящее время ситуация меняется, особенно в области устойчивости к болезням — например, при передаче устойчивости к пухоеду от A. roylei новые методы позволяют вывести коммерчески устойчивые сорта (Kik, 2002).

Генетическая трансформация уже позволила получить устойчивые к гербицидам и насекомым-вредителям сорта аллиума, использование которых может снизить потребность в пестицидах и упростить управление посевами. Однако, несмотря на экологические преимущества от использования меньшего количества и более безопасных пестицидов и маловероятность каких-либо рисков от трансгенных аллиумов (Eady, 2002), сохраняется определенная враждебность к трансгенным культурам, что препятствует их коммерциализации во многих странах. Создание гибридных сортов, похоже, было доминирующей тенденцией в селекции лука в течение последних 50 лет, сначала в США, а затем в Европе и Японии. Несмотря на это, Даукер и Гордон (1983) отметили, что существует мало опубликованных данных, свидетельствующих о том, что гибридные сорта более урожайны, более однородны или имеют лучшее качество, чем лучшие открытоопыляемые сорта.

Сравнение гибридных и открыто опыляемых (ОП) коротко- и среднедневных сортов в Нью-Мексико, США, показало, что ОП сорта показали лучшие результаты по сравнению с гибридами по товарному качеству, устойчивости к болезням (розовый корень) и урожайности, в основном потому, что гибриды дали больше завязей (Cramer, 2001). Однако эта разница может просто отражать важность отбора для местной адаптации лука, поскольку многие из тестируемых сортов ОП были получены в результате давней программы селекции сортов ОП в Университете штата Нью-Мексико, а гибриды были получены от селекционеров из Калифорнии.

Отчасти привлекательность гибридных сортов заключается в контроле над ними со стороны селекционера и производителя семян: их нельзя воспроизвести из семян, сохраненных фермерами, поэтому труд, вложенный в их разработку, не может быть пиратским. С другой стороны, низкие и непостоянные урожаи семян иногда делают гибридные сорта недоступными, а семена гибридов стоят в два-три раза дороже ОП (Cramer, 2001). Кроме того, выведение гибридов занимает много времени и требует сложного селекционного и семеноводческого оборудования. Генетическая база гибридных сортов узкая, и они содержат меньше генетической изменчивости, чем открыто опыляемые сорта, поэтому они могут быть менее приспособлены к аномальным, стрессовым условиям (Pike, 1986).

По всем этим причинам они не всегда являются лучшим способом улучшения сельскохозяйственных культур, особенно в некоторых бедных тропических странах, где существует большая потребность в улучшении лука. В этих странах, а также в более богатых регионах с умеренным климатом, старые сорта с открытым опылением заменяются новыми, часто гибридами, от транснациональных семенных компаний (Currah and Proctor, 1990). Старые сорта часто сохранялись благодаря семенам, сохраненным фермерами. Те же тенденции были отмечены для сортов лука-батуна и для лука-порея в Европе (de Clercq and van Bockstaele, 2002).

Как отмечалось ранее, важно, чтобы генетическое разнообразие, представленное традиционными сортами, было сохранено и не утрачено. Эти тенденции в селекции аллиума типичны для многих сельскохозяйственных культур. Существует интересная и продолжающаяся дискуссия о том, соответствуют ли коммерческие интересы, направляющие селекцию сельскохозяйственных культур, долгосрочным общественным интересам, особенно интересам более бедной части населения мира (Mooney, 1979). Отчасти в результате этих дебатов различные государственные и благотворительные организации участвуют в генетическом сохранении аллиевых культур, координируемом Международным советом по генетическим ресурсам растений (Astley, 1990). Таким образом, очевидно, что многие возможности и конфликты, возникающие в связи с новыми биотехнологиями, глобализацией селекционных и семеноводческих компаний и геополитическими дебатами о сохранении и использовании генетических ресурсов, хорошо иллюстрируются тенденциями в селекции и маркетинге семян аллиума.

Методы селекции и улучшения сортов

Программы улучшения культур, используемые в настоящее время для съедобных аллиумов, включают:

  1. простой отбор желательных отдельных растений из популяции для использования в скрещивании и производстве семян;
  2. использование повторных испытаний и статистических измерений средней производительности различных линий или семейств в программе селекции для выбора тех, которые будут сохранены и объединены в улучшенный сорт;
  3. создание гибридных сортов F1 и тройного скрещивания. Наиболее подходящий метод зависит от того, насколько хорошо развиты существующие сорта, а также от опыта и ресурсов, имеющихся для селекции. Приведенные ниже примеры реальных программ селекции лука иллюстрируют эти различные подходы. Эти методы селекции обобщены на рис.
Сводная схема методов селекции, используемых для выведения новых сортов лука. (1) Первый этап селекции гибридов: получение мужских стерильных и поддерживающих линий из адаптированных к местным условиям типов. (2) Параллельные этапы улучшения путем массового отбора, создания "синтетических" сортов или выведения гибридных сортов.

Массовый отбор

Currah (1985) описал селекционную программу по выведению сортов лука, подходящих для Эфиопии, из довольно изменчивых суданских сортов. Было произведено около 2000 луковиц, которые были отобраны для устранения нецветных, двойных, толстошеих и мелких луковиц из популяций с красными, коричневыми и белыми луковицами. Около половины луковиц было сохранено из каждого посева, хотя в большинстве подобных программ отбирается только 1-5% растений. Их пересаживали и давали возможность цвести и перекрестно опыляться в популяции каждого цвета. Семена собирали и вновь высевали, как только они созревали, и весь процесс повторялся ежегодно. В большинстве климатических условий необходим двухгодичный цикл с производством луковиц в первый год и производством семян во второй год. Пяти таких циклов было достаточно, чтобы вывести улучшенный сорт каждого цвета, способный производить луковицы экспортного качества. Этот метод селекции известен как «массовый отбор».

Постоянный отбор луковиц во время обычного производства семян необходим для поддержания качества таких сортов. Массовый отбор эффективен, когда, как в данном случае, требуется довольно большой сдвиг для адаптации селекционной популяции к новой местности, и, как следствие, отклонение от типа является многочисленным и очевидным. Массовый отбор, вероятно, широко использовался для выведения открытых опыляемых европейских сортов лука до 1980-х годов (Dowker et al., 1984). Массовый отбор прост, не требует специальных знаний в области селекции растений и поэтому подходит там, где нет достаточного опыта или технологий. Однако там, где популяции уже сильно размножены и улучшены, становится трудно продвигаться вперед с помощью таких простых методов.

Селекция линий

Селекция улучшенных открытоопыляемых популяций лука в Великобритании была описана Даукером и др. (1984). Достаточно широкий спектр североевропейских сортов был самоопылен и инбреден в течение одного-трех поколений. Полученные инбредные линии выращивались в повторных опытах, а луковицы оценивались по:

  • внешнему виду (сохранение кожицы, цвет и форма);
  • урожайности (включая учет доли толстошеих растений и дату созревания);
  • сроку хранения.

Отобранные линии затем скрещивались между собой для создания новой «синтетической» аутбридинговой популяции. Отбор был основан на средней производительности инбредных линий, а не на отдельных луковицах. Те линии, которые были значительно лучше контрольного сорта хотя бы по одному набору свойств и не были значительно хуже по любому другому, скрещивались между собой. Контролем служил один из исходных хорошо адаптированных сортов, использованных в качестве исходного материала. Равные массы семян, сохраненных от каждого родителя при скрещивании, были собраны и выращены до луковицы, а растения из 100 отобранных луковиц были массово опылены для получения семян полученного «синтетического сорта» для использования в испытаниях, повторенных в трех местах. Затем цикл инбридинга, отбора и синтеза был повторен, используя популяцию из первого цикла в качестве отправной точки.
Урожайность увеличилась на 5,5%, а процент луковиц, прорастающих в хранилище к апрелю, снизился на 7,5% за цикл. Повышение урожайности было аналогично тому, о котором сообщалось для кукурузы при аналогичном режиме селекции. Такая программа селекции может быть достаточно «бессрочной». Количество поколений инбридинга и количество циклов селекции может варьироваться, а новые перспективные линии могут быть введены в последовательность на любом этапе (Dowker, 1990). В качестве «линий» в такой программе могут использоваться не только инбредные, но и частично инбредные линии — например, полусибсы, получаемые в результате изолированного выращивания семян от одного материнского растения. Отбор линий заменил массовый отбор в порее, начиная с 1960-х годов, и привел к тому, что современные сорта в значительной степени заменили более старые, массово отобранные земные сорта (de Clercq and van Bockstaele, 2002).

Гибриды

Если определенная мужская стерильная линия скрещивается с определенным донором пыльцы для получения энергичного гибрида F1 с желаемыми признаками, то мы получили гибридный сорт. Чтобы достичь этого момента, обычно требуется много лет тщательной работы.

Во-первых, возникает проблема, как воспроизвести мужскую стерильную материнскую линию, неспособную к самоопылению. В ранних работах Джонс и Кларк поддерживали мужскую стерильность вегетативно, используя луковицы, образующиеся на головке цветка. Однако бульбочки трудно хранить, а вирусы имеют тенденцию накапливаться в растениях. Чтобы преодолеть эти проблемы, они вывели мужские фертильные «поддерживающие линии» с генетической конституцией Nmsms для мужской стерильности, но в других отношениях генетически почти такие же, как мужская стерильная линия. Такая линия, как показано выше, будет производить пыльцу, которая может оплодотворить мужскую стерильную линию Smsms, потомство останется Smsms и, следовательно, мужским стерильным, но генетически не будет отличаться от родительской мужской стерильной линии. Таким образом, линия Nmsms позволяет производить последовательные поколения семян мужско-стерильной линии, отсюда и ее название «поддерживающая линия».

Необходимо создать мужские стерильные и поддерживающие линии, которые имеют потенциал для получения хороших гибридов. Это означает, что эти линии должны быть хорошо адаптированы к местности, где будет выращиваться гибрид. Мужские стерильные растения были обнаружены с очень низкой частотой в ряде популяций лука. Кроме того, растения с конституцией Nmsms, т.е. генотипы-майнеры, встречаются с частотой около 5% в большинстве популяций (Pike, 1986). Если скрещивание между таким мужским стерильным открытием и фертильным растением дает потомство, которое все является мужским стерильным, селекционер сразу же получает новую мужскую стерильную и поддерживающую линию. Обычно, однако, новые мужские стерильные линии должны быть созданы с использованием известных мужских стерильных растений из неадаптированного источника — например, от селекционера из другой местности. Такие растения скрещиваются с несколькими особями из местной адаптированной популяции, и потомство выращивается до цветения. Любое такое скрещивание, дающее 100% мужско-стерильное потомство, служит для идентификации первоначального донора пыльцы как Nmsms, и, следовательно, как поддерживающей линии. Обычно в таких тестовых скрещиваниях используются линии, инбредные в течение одного-трех поколений, что позволяет устранить из популяции многие нежелательные рецессивные аллели и повысить гомозиготность линий. Это гарантирует, что конечные полученные гибриды будут достаточно однородными генетически и, следовательно, будут иметь одинаковый рост и развитие.

После идентификации линии мейнтейнера в местной адаптированной инбредной популяции, мужская стерильная линия должна быть развита таким образом, чтобы она была практически идентична ей генетически, за исключением наличия цитоплазматического фактора S. Это делается путем многократного скрещивания мужского стерильного потомства с исходной Nmsms-адаптированной линией мейнтейнера. Это достигается путем многократного скрещивания мужского стерильного потомства с исходной Nmsms-адаптированной линией мейнбредной популяции. С каждым поколением такого скрещивания генетический вклад исходного стерильного родителя Smsms разбавляется в два раза, так что после четырех поколений такого «обратного скрещивания» 96,875% генов в полученной линии Smsms происходят от исходной линии Nmsms, и она достаточно похожа для использования в качестве мужской стерильной линии в тестовых скрещиваниях для выявления энергичных гибридов.

Только определенные скрещивания приводят к желательным F1, и поэтому для того, чтобы программа гибридного разведения имела хорошие шансы на успех, необходимо разработать ряд адаптированных пар мужских стерильных и поддерживающих линий. Селекционер должен провести множество скрещиваний со своими мужскими стерильными линиями, вырастить и оценить потомство, чтобы определить, какие из них дают желательные гибриды. Накапливая данные от таких тестовых скрещиваний, он/она может накопить информацию, которая поможет предсказать, какие скрещивания дадут хорошие гибриды. Как и в случае с линиями-сохранителями, линии-доноры пыльцы, используемые для получения гибридов, обычно инбредны, чтобы устранить из генофонда вредные рецессивные и внетиповые аллели.

Выведение новых гибридов лука занимает 15-20 лет, поскольку большинство циклов селекции лука от семени до семени составляет 2 года. Семена высеваются, луковицы отбираются, собираются и хранятся в первый год. На второй год отобранные луковицы выращиваются для цветения и производства семян.

Поскольку линии, дающие гибриды, являются инбредными, они часто слабые и могут давать низкий урожай семян. Для того чтобы гибрид был коммерчески жизнеспособным, необходима возможность получения достаточного количества семян. Родительские линии гибрида также должны цвести одновременно, чтобы происходило их перекрестное опыление. Если скрещивать мужскую стерильную линию с неродственной поддерживающей линией, то полученный гибрид будет сам по себе мужски стерильным. Будучи гибридом, он вполне может быть более энергичным, чем родительские линии, и, следовательно, иметь больший потенциал для производства семян. Этот мужской стерильный гибрид может быть скрещен с другой мужской фертильной линией для получения так называемого «трехстороннего гибрида». Дополнительная сила мужского стерильного родителя в трехстороннем гибриде облегчает производство семян, но при этом теряется часть генетической однородности F1 между двумя инбридами. Как и в случае с двусторонними гибридами, необходимо создавать и испытывать различные комбинации трехсторонних гибридов.

Поскольку в популяциях лука содержится много вредоносных рецессивных генов, обычно возможно самоопылить линии всего два или три раза, прежде чем они станут слишком слабыми для выращивания. Следовательно, гибриды между такими инбредными линиями не являются генетически или фенотипически полностью однородными. Кроме того, поскольку инбредные линии остаются достаточно гетерозиготными, их генетическая структура может со временем измениться в результате дрейфа или отбора, что может пагубно сказаться на создаваемых ими гибридных сортах.

Альтернативой инбридингу как средству повышения генетической однородности (гомозиготности) является использование в качестве родительских линий для производства гибридов полностью гомозиготных диплоидных растений, полученных путем удвоения хромосом гаплоидных растений (Bohanec, 2002). Несколько семенных компаний уже используют двойные гаплоидные линии в гибридной селекции. Гаплоидные растения могут быть получены путем культивирования тканей нераскрывшихся цветков на гелевой среде, содержащей основные минеральные питательные вещества, сахарозу и регуляторы роста растений 2,4-D и BAP. При соответствующих условиях и концентрациях в культуральной среде примерно через 100 дней цветочные завязи могут дать начало проросткам с половиной нормального числа хромосом, т.е. гаплоидам (Bohanec, 2002). У некоторых гаплоидов происходит спонтанное удвоение хромосом, в результате чего образуются гомозиготные диплоидные растения. Внешний вид растущих растений и луковиц как гаплоидов, так и удвоенных гаплоидов вполне нормальный, за исключением того, что гаплоиды дают только рудиментарные соцветия, в то время как у диплоидов цветение нормальное. Выход гаплоидов на 100 культивируемых цветков колеблется от 0 до 50-60% в зависимости от генетического состава родительской линии, хотя обычно он составляет всего несколько процентов в типичных тестируемых аутбредных сортах.

Сам процесс гаплоидной регенерации должен устранить те генотипы, которые несут отклоняющиеся рецессивные гены, препятствующие развитию сеянца. Тем не менее, не происходит автоматического отбора рецессивных генов, нарушающих цветение и плодоношение, и двойные гаплоидные линии обычно имеют низкую плодовитость. Тем не менее, должно быть возможно улучшить фертильность путем циклов скрещивания удвоенных гаплоидов, которые являются фертильными, регенерации новых гаплоидов от этих скрещиваний с последующим удвоением для получения диплоидов и их отбора на фертильность. Полевые испытания, сравнивающие двойные гаплоидные линии, гибриды F1 между двойными гаплоидами и мужскими стерильными селекционными линиями и существующие открыто опыляемые сорта, показали, что двойные гибриды были более однородными, но меньшими по размеру и менее урожайными, чем существующие сорта (Kim et al., 2007). Средний вес луковицы двойных гаплоидов составлял 60% от среднего веса существующих сортов на одном участке, и 85% на другом. Средний размер и урожайность гибридов F1 приближались или превышали таковые у существующих сортов в зависимости от участка. Использование двугаплоидных линий в качестве родителей для гибридов F1 должно позволить вывести высокооднородные сорта лука, выражающие максимальную гибридную силу (Bohanec, 2002).

Контроль опыления при селекции

Из описанных выше процедур очевидно, что контроль опыления имеет фундаментальное значение для селекции. При простой массовой селекции селектируемая популяция должна быть изолирована от посторонней пыльцы, особенно от пыльцы сортов с другим цветом луковицы. Изоляция может быть достигнута путем производства семян на полях, отстоящих друг от друга более чем на 1,5 км. Такая же изоляция необходима для крупномасштабного производства семян из открыто опыляемых линий, полученных в результате селекции линий, или при производстве гибридных семян. Для производства небольших количеств семян загрязнение нежелательной пыльцой достигается путем изоляции линий для скрещивания в защищенных от насекомых клетках из нейлоновой сетки (рис. a).

Контроль опыления в селекции лука. (a) Луковые зонтики, собранные для перекрестного опыления в защищенной от насекомых опылительной "клетке" с нейлоновыми сетчатыми стенками. (b) Зонтик, закрытый целлофановыми пакетами с мухами для самоопыления (Warwick HRI).

Для контролируемого скрещивания между парами линий цветочные головки попарно помещают в небольшие сетчатые клетки или в целлофановые пакеты, а для распространения пыльцы вводят мух. Самоопыление достигается простым путем заключения одной цветочной головки в такую клетку или пакет и введения мух (рис. b). В небольших масштабах для ручного опыления цветов можно использовать кисточку. Контролируемое скрещивание при избежании самоопыления может быть достигнуто в небольших масштабах путем удаления пыльников с материнских растений до того, как они созреют и сбросят пыльцу, процесс называется «эмаскуляция».

Цели селекции съедобных представителей лука

Знания генетики и методы селекции, рассмотренные выше, применяются для продвижения улучшения сельскохозяйственных культур в направлении определенных конкретных целей или задач, которые должен поставить селекционер. Некоторые цели, такие как высокая урожайность, питательный конечный продукт и устойчивость к вредителям и болезням, являются универсально желательными. Другие — например, цвет и форма луковиц — определяются предпочтениями покупателей. Цели последнего рода часто варьируются в зависимости от местности и рыночной ниши, определенной для улучшенного сорта. Обычно положительный отбор ограничивается несколькими основными признаками одновременно, иначе программа селекции становится неуправляемо большой.

Сорта репчатого лука делятся на основные категории:

  • типы для хранения;
  • сладкие типы для потребления в виде сырых луковиц;
  • для сушки;
  • типы для зеленого салата.

Универсальными желательными признаками сортов, выращиваемых для получения луковиц, являются:

  • однородность размера, формы, цвета и даты созревания луковиц;
  • высокая урожайность;
  • подходящий срок созревания;
  • устойчивость к болезням и вредителям;
  • устойчивость к полеганию;
  • неповрежденная привлекательная кожура;
  • тонкая шейка;
  • одноцентровые луковицы (без двойных и раздвоенных луковиц);
  • упругая мякоть.

Чтобы достичь многих из этих показателей, сорт должен быть хорошо адаптирован к климату, главным образом, к длине дня и температуре сезона и местности, в которой он выращивается. Кроме того, луковицы для длительного хранения должны обладать врожденной продолжительностью покоя, твердой мякотью, прочной кожицей и, для большинства рынков, жгучестью. Свежие луковицы должны иметь мягкий вкус, сладкую и хрустящую мякоть, и здесь особенно важны одиночные центры с крупными концентрическими кольцами. Сухофрукты должны иметь высокое содержание сухого вещества, белую мякоть и кожицу, а также низкое содержание редуцирующих сахаров. Кроме того, для дегидраторов желательны луковицы сферической, а не плоской формы, поскольку это облегчает механическую обрезку шейки и корней с минимальными потерями мякоти луковицы.

Примерами более «косметических» факторов, которые, как правило, обусловлены культурой, являются предпочтение северных европейцев к круглым, коричневым или желтым луковицам, в отличие от японцев, предпочитающих более плоские луковицы. Такие предпочтения могут меняться; например, красный лук сейчас популярен в Великобритании, тогда как в 1980-х годах такие луковицы там встречались редко. Поскольку предпочтения меняются в зависимости от рынка, невозможно полностью определить характеристики «идеального лука».

Мессиан и др. (1993) описывают цели селекции чеснока следующим образом:

  • гладкие, круглые луковицы без видимых дефектов;
  • равномерное распределение размера зубчиков внутри луковицы;
  • низкая доля двойных или множественных зубчиков;
  • равномерный цвет кожицы и мякоти, который может варьироваться от белого до красного или фиолетового в зависимости от предпочтений потребителей.

Цели селекции лука-порея обычно подчеркивают большую длину ствола и темно-зеленую листовую пластинку в дополнение к высокой урожайности. В отличие от лука, развитие лука-порея не зависит от длины дня и температуры, поэтому сорта лука-порея адаптированы на гораздо более широкой территории, чем лук. Климатическая адаптация — это вопрос наличия быстрорастущих сортов для весеннего и раннелетнего выращивания и выносливых сортов, способных стоять на улице всю зиму. Зимостойкость обычно связана с короткой длиной ствола. Важна однородность: порей значительно различается по размеру при сборе урожая, даже после пересадки рассады одинакового размера. При выращивании прямым посевом или в модулях необходимо получить равномерно энергичную рассаду. Сеянцы существующих сортов лука-порея различаются по силе роста, возможно, из-за большого количества делетерных рецессивных генных аллелей, существующих в популяциях. Как упоминалось ранее, гибридные сорта менее изменчивы, чем открыто опыляемые. Устойчивость к вирусу желтой полосы лука-порея и ржавчине лука-порея (Puccinia allii) также являются важными целями селекции (Pink, 1992).

В последние годы коммерческие сорта японского пучкового лука все больше вытесняют семена, сохраненные фермерами в Японии. Новые сорта, включая гибриды F1, были выведены для повышения устойчивости к полеганию, устойчивости к высокой температуре и улучшения качества. Цели по качеству различаются между теми, которые выращиваются для длинных псевдостеблей, и теми, которые выращиваются для нежных зеленых листьев (Inden and Asahira, 1990).

Селекция шнитт-лука была сосредоточена на сортах для выращивания в качестве «вынужденной» культуры зимой. Целями являются прямостоячие, длинные листья большого диаметра (> 3,6 мм), энергичное ветвление побегов, позднее цветение и высокая урожайность. Были выведены гибридные сорта F1, которые превосходят по урожайности открыто опыляемые принудительные сорта (Poulsen, 1990).

Методы отбора и влияние окружающей среды

Для отбора по целям селекции, перечисленным в предыдущем разделе, селекционер должен разработать соответствующие способы измерения выбранных характеристик. Для некоторых целей он/она должен убедиться, что испытания оказывают высокое «давление отбора» для интересующих признаков. Кроме того, эффективные методы селекции зависят от знания того, как окружающая среда влияет на селекционируемые признаки. Поскольку развитие лука-батуна так тесно зависит от климата, важно, чтобы селекционные испытания проводились в том регионе, где предполагается выращивать все полученные в результате улучшенные сорта.

Многие цели селекции лука могут быть оценены визуально и количественно с помощью простой системы баллов. Это относится к форме, цвету, сохранению кожицы, толщине кожицы и однородности. Можно оценить сроки созревания, например, когда 50 или 80% растений демонстрируют опавшую листву. Ранний посев селекционных линий перезимовавших культур с целью максимального увеличения количества завязей является примером того, как давление отбора может быть увеличено сверх нормы. Хранение лука можно оценить как процент луковиц, проросших или сгнивших после определенного времени в типичных условиях хранения. Содержание растворимых твердых веществ, важное для селекции сортов на обезвоживание, можно оценить по показаниям рефрактометра в соке, выделенном из луковицы. Отобранные луковицы все равно можно использовать для посадки. Для оценки вкуса существуют различные методы, но большинство селекционеров по-прежнему используют дегустационные панели. Было разработано множество специальных тестов на устойчивость к вредителям и болезням в дополнение к грубым полевым наблюдениям.

В отсутствие непрерывного отбора для поддержания качества сортов, опыляемых открытым способом, некоторые желательные признаки могут выродиться. Непрерывный отбор необходим для поддержания устойчивости к полеганию, одноцентровых луковиц, круглой формы луковицы, высокого содержания сухого вещества и длительного периода покоя, поскольку в отсутствие отбора сорта имеют тенденцию «дрейфовать» в сторону от этих идеалов (Pike, 1986). Любой признак, который имеет тенденцию к повышению урожайности семян, будет становиться все более заметным при многократном размножении семян в отсутствие отбора против него. Например, более плоская форма луковицы связана с внутренним ветвлением, так же как и множественные центры, и оба эти признака, скорее всего, приведут к образованию множества цветочных головок на растении, следовательно, к увеличению урожая семян с одного растения.

На все важные признаки влияет как окружающая среда, так и генотип. Сравнивая показатели селекционных линий с хорошо охарактеризованными контрольными сортами, которые обычно выращиваются с большим количеством повторений, чем тестируемые линии, можно исключить некоторые влияния окружающей среды. На многие признаки, включая размер луковицы, форму, дату созревания, процент толстошейных и двойных луковиц, влияет плотность популяции, в которой выращиваются растения (Dowker and Fennell, 1974). Селекционеры должны учитывать эти тенденции при отборе. Урожайность луковиц также сильно зависит от плотности. При прямом посеве лука невозможно добиться постоянной плотности популяции растений. Чтобы преодолеть эту трудность, контрольный сорт можно выращивать при различной плотности популяции и вывести математическую зависимость между урожайностью и плотностью популяции. Затем урожайность селекционной линии можно сравнить с урожайностью контрольного сорта при той же плотности популяции, как предсказывает эта зависимость (Dowker, 1990). Некоторые селекционеры используют пересаженную рассаду, выращенную при фиксированной плотности, чтобы преодолеть проблемы, связанные с различиями в плотности растений. Важно избежать непроизвольного отбора наиболее энергичных сеянцев при пересадке таких проб.

Плотность растений также влияет на важные селекционные признаки лука-порея. При более высокой плотности растений отношение длины ствола к ширине увеличивается, и, следовательно, стволы кажутся длиннее и тоньше. В пересаженных культурах более глубокая посадка приводит к увеличению длины стволов.

Селекция на урожайность вегетативно размножаемых культур аллиума затруднена, поскольку размер посадочного материала, например, зубчика чеснока или луковицы шалота, а также условия, в которых он был выращен, например, плотность посадки, влияют на его потенциал урожайности. Простой массовый отбор самых крупных и красивых луковиц дает незначительные улучшения (Messiaen et al., 1993). Вместо этого, путем посадки зубчиков из отобранных отдельных луковиц чеснока, был создан ряд клоновых семейств. Впоследствии эти семьи были высажены в сравнительных испытаниях, и были отобраны самые урожайные семьи с самыми высокими средними значениями продукта (вес собранной луковицы х умножение веса между посадкой и сбором урожая). Весовое умножение — это просто вес собранной луковицы, деленный на вес посаженной гвоздики. Высокоурожайные клоны отбираются на основе результатов таких испытаний за несколько лет (Messiaen et al., 1993). Для шалота трудно разработать простой селекционный индекс, если только материнские луковицы не происходят с одного участка и не имеют одинакового размера.

Генетическая трансформация лука

Eady (2002), рассматривая эту тему, ограничил термин «генетическая трансформация» передачей охарактеризованного набора генов с помощью технологий вставки генов в отличие от введения нехарактеризованной ДНК при скрещивании с дикими сородичами или путем искусственного слияния клеток различных видов allium (Buiteveld et al., 1998). Для трансформации растений с дискретными, охарактеризованными генами, последовательности ДНК должны быть доставлены в клетку и встроены в хромосомы. Ген должен быть отрегулирован таким образом, чтобы он экспрессировался нужным образом, а трансформированная клетка должна пролиферировать и произвести проросток, который можно охарактеризовать и отобрать как содержащий вставленную ДНК. Наконец, отобранное трансформированное растение должно быть закалено, выращено и оценено в нормальных условиях культуры.

Сообщалось об успешной генетической трансформации лука, лука-шалота, чеснока и лука-порея (Eady, 2002; Eady et al., 2003a, b, 2005; Zheng et al., 2004). Наиболее широко используется система вставки генов с использованием бактериального вектора Agrobacterium. Agrobacterium дикого типа заражает корни и переносит определенный участок ДНК, известный как Т-ДНК, в геном растения-хозяина. Инфицированные клетки разрастаются и образуют опухоль, которая служит источником питания для размножающихся бактерий. Удалось подавить индукцию опухоли и добавить разработанные последовательности ДНК к t-ДНК Agrobacterium и использовать его способность вставлять ДНК для включения кодирующих генов в геномы растений. Вместе с ДНК, необходимой для получения желаемого нового свойства, должна быть вставлена «промоторная» ДНК, кодирующая гены для регуляции нового гена, т.е. для его «включения», когда это необходимо, а также ДНК, кодирующая «репортерные» гены. Репортерные гены кодируют свойства, которые позволяют отбирать трансформированные проростки от тех, которые имеют немодифицированные геномы, и которые могут быть использованы для проверки того, что последовательность трансформации была включена.

Промоторы, полученные от вируса мозаики цветной капусты, а также от хризантемы, были использованы для трансформации аллиума. Гены устойчивости к гербицидам и антибиотикам используются в качестве репортеров для отбора трансформированных клеточных культур, поскольку только те из них, которые обладают этими свойствами, могут выжить в ростовой среде, в которую добавлен соответствующий антибиотик или гербицид. Ген, кодирующий флуоресцентный белок, также использовался для выявления трансформированных проростков по их способности флуоресцировать зеленым цветом при освещении синим светом (Eady, 2002; Zheng et al., 2004). Процесс трансформации применялся к незрелым зародышам, вырезанным из развивающихся семян и культивированным вместе с Agrobacterium в соответствующей жидкой среде для культуры тканей. Эти культуры являются источником клеток, которые могут быть как трансформированы, так и регенерированы. Различные группы разработали системы пролиферирующих клеток в культуре, пригодных для генетической трансформации (например, Fereol et al., 2005). Дедифференцированные клетки, называемые «каллусными клетками», проблематичны для трансформации аллиума, поскольку они могут быть генетически нестабильными и давать спонтанные «сомаклональные» генетические вариации, и их трудно регенерировать в дифференцированные проростки (Novak, 1990; Eady, 2002).

С помощью этих методов на нескольких открыто опыляемых сортах и гибридных родительских линиях были сконструированы растения лука, устойчивые к гербицидам, содержащим глифосат и фос-финотрицин (глуфосинат), и показано, что они экспрессируют гены и наследуют их обычным менделевским способом (Eady et al., 2003a, b). Растения росли и развивались нормально (рис. a). Такие растения были способны выдерживать промышленные концентрации гербицидов, показывая, что с сорняками в посевах такого рода можно бороться с помощью одного современного гербицида в низкой дозе, быстро разлагающегося в почве, а не с помощью сложных программ до- и послевсходового внесения нескольких гербицидов, которые необходимы в настоящее время. Устойчивость к насекомым также была сконструирована в шалоте и чесноке. Еще одно потенциально полезное преобразование было достигнуто путем введения в лук «антисмыслового» гена аллииназы. Они частично блокируют экспрессию фермента аллииназы, ответственного за образование вкуса и аромата, и поэтому должны влиять на уровень содержания ароматических соединений (Eady, 2002).

Генетически модифицированный лук
Генетически модифицированный лук. (a) Листья лука через 10 дней после опрыскивания контактным гербицидом фосфинотрицином: (слева) листья Bar-положительного растения, генетический маркер, указывающий на наличие гена устойчивости к гербициду; (справа) листья нетрансгенных растений (из Eady et al., 2003b). (b) (слева) Нетрансгенные листья шалота, подверженные воздействию свекловичного армейского червя, Spodoptera exigua. (справа) Листья устойчивых растений, генетически трансформированных для экспрессии токсичного для насекомых белка, кодируемого геном cry1Ca, полученным из Bacillus thuringiensis (Zheng et al., 2005).

Более эффективным методом блокирования действия определенных генов, или «глушения генов», является РНК-интерференция (RNAi), которая основана на мощном природном механизме поиска и уничтожения вредных транскрибируемых РНК, включая вирусы. Этот метод был применен для создания «бесслезного» лука путем подавления выработки фермента синтазы лакриматорного фактора (LFS), катализирующего реакцию, в результате которой образуется летучий лакриматорный фактор при разрезании луковиц (Eady, 2007).

Поскольку генетическая трансформация лука все еще сложна, и от трансформации до получения луковиц проходит 1 год, конструкция для подавления гена LFS была впервые разработана на растениях табака, которые лучше поддаются генетической трансформации. Были выведены трансгенные растения табака, продуцирующие LFS, а вторая трансформация с RNAi конструкцией, направленной против РНК, продуцирующей LFS, была введена и показана для подавления производства LFS в «модельной» системе табака. Генетическая конструкция, подавляющая LFS, которая, как было показано, работает в трансгенном табаке, была затем введена в лук. Введенная система RNAi ищет, нарезает и, следовательно, уничтожает специфическую РНК, кодирующую LFS.

Таким целенаправленным образом подавляется выработка раздражающего лакриматорного фактора, и вместо того, чтобы теряться в виде LF, предшественники должны направляться на образование большего количества других ароматических соединений, полезных для здоровья. Система RNAi показывает большие перспективы для манипулирования генетической системой лука с целью повышения производства желательных для питания вторичных метаболитов и развития устойчивости к вирусным заболеваниям, а также является мощным инструментом для фундаментальных исследований метаболических путей в растениях (Eady, 2007).

Селекция на устойчивость к болезни и вредителям

Растущее общественное и политическое давление, направленное на минимизацию использования пестицидов, привело к тому, что все больше внимания уделяется селекции сортов с устойчивостью или толерантностью к болезням и нападению вредителей. Заметный успех в селекции на устойчивость был достигнут в борьбе с розовым корнем лука, почвенным заболеванием теплых регионов. Ранние исследования показали наличие одного рецессивного аллеля, передающего устойчивость к этому заболеванию у сортов типа Бермуда. Он был успешно перенесен на другие сладкие сорта, подходящие для юга США. Более поздние исследования показали восприимчивость к другим штаммам грибка у устойчивых сортов (Pike, 1986).

Это иллюстрирует важный момент, что устойчивость, особенно та, которая передается одним геном, может разрушиться перед лицом новых штаммов патогена. Организмы болезней и вредителей обычно имеют короткое время генерации и быстрые темпы эволюции — факторы, способствующие скорейшему разрушению устойчивости сортов, особенно если они внедряются повсеместно и постоянно. Различные степени устойчивости, указывающие на влияние ряда генов с небольшим эффектом, также наблюдались для болезни розового корня. Такая полигенная устойчивость может быть не такой полной, как одногенная, но она менее подвержена катастрофическому разрушению перед лицом нового, вирулентного штамма патогена, чем одногенная устойчивость.

Allium fistulosum обладает высокой устойчивостью к розовому корню, а также к другим важным заболеваниям лука, таким как шейковая гниль, антракноз, парша и листовая гниль, вызываемая Botrytis squamosa. В связи с этим было получено много межвидовых гибридов между A. fistulosum и обычным луком, которые оказались устойчивыми к розовому корню. Один или два из этих гибридов выращиваются как пучковый лук, но обратное скрещивание гибридов с репчатым луком для включения устойчивости в приемлемый сорт лука оказалось трудным, поскольку гибриды в основном стерильны. Эта стерильность является результатом различных аномалий мейоза у гибридов, которые были подробно проанализированы (Kik, 2002).

В попытке преодолеть стерильность и, следовательно, перенести некоторые гены устойчивости к заболеваниям, обнаруженные у A. fistulosum, в A. cepa, некоторые скрещивания между этими двумя видами сопровождались преднамеренным удвоением числа хромосом. В результате пары гомологичных хромосом из A. fistulosum и A. cepa могут спариваться друг с другом во время мейоза и происходит нормальное скрещивание, приводящее к образованию жизнеспособных пыльцы и яйцеклеток (Jones and Mann, 1963). Такие растения называются амфидиплоидами, примером которых является сорт ‘Beltsville Bunching’, выращиваемый из семян как второстепенная культура в США. Амфидиплоид от скрещивания шалота и A. fistulosum, который был обратно скрещен с шалотом, дал начало энергичному, устойчивому к розовым корням, похожему на шалот сорту ‘Delta Giant’, который выращивается для луковиц в Луизиане. Это триплоид с 24 хромосомами, два набора из восьми получены от шалота и один набор от A. fistulosum. Восточный лук Вакеги — диплоидный гибрид между шалотом и A. fistulosum, но он размножается вегетативно.

Несколько групп продемонстрировали некоторый обмен генетическим материалом между гомологичными хромосомами двух видов при беккроссе гибрида с A. cepa (Kik, 2002). Совсем недавно было показано, что и A. cepa, и A. fistulosum скрещиваются с диким видом A. roylei для получения фертильных гибридов. Allium roylei является диплоидом с количеством ДНК в хромосомах, промежуточным между двумя культурными видами. При скрещивании A. cepa с гибридом A. fistulosum х Alium roylei для получения трехстороннего гибрида удалось показать, что между гомологичными хромосомами всех трех видов происходит перекрест и, следовательно, генетический обмен. Более того, точки рекомбинации были случайным образом распределены по хромосомам и не ограничивались ограниченной областью вблизи центромеры, как это происходит у A. fistulosum (Kik, 2002). Таким образом, A. roylei может выступать в качестве генетического «моста», который может сделать интрогрессию полезных генов из A. fistulosum в обычный лук практически возможной.

Интерес к A. roylei возник, когда было обнаружено, что он полностью устойчив к луковой пуховой росе и частично устойчив к поражению луковой листовой гнили, B. squamosa. Гибрид между A. roylei и A. cepa производил пыльцу с небольшим количеством хромосомных аномалий, поэтому был фертильным и мог быть обратно скрещен с A. cepa. Было показано, что устойчивость к мучнистой росе обусловлена одним доминантным геном, который был назван «Pd» и расположен на одном конце хромосомы 2 у A. roylei. Это было показано на основе генетической карты сцепления, основанной на молекулярных маркерах, и путем прямой визуализации ДНК-маркера гена Pd на хромосоме с помощью флуоресцентного пятна, связанного с зондовой ДНК.

Была разработана последовательность ДНК из 20 пар оснований, тесно связанная с Pd, которая может быть амплифицирована для облегчения идентификации (так называемый «маркер, характеризуемый последовательностью амплифицированного региона» (SCAR)). Генетическое картирование скрещиваний между A. roylei и луком показало, что ген устойчивости к милдью расположен в конце хромосомы 3 (Scholten et al., 2007). Дискриминационная способность маркера SCAR показывать только устойчивые к милдью генотипы снизилась во время программы многократного обратного скрещивания генотипов, несущих устойчивость, с луком для получения устойчивого лука хорошего качества. Следовательно, необходимо было разработать новые AFLP-маркеры для гена устойчивости (Scholten et al., 2007). Кроме того, было обнаружено, что область фрагмента A. roylei, введенная в лук, была летальной, когда она была гомозиготной в генетическом фоне лука.

Однако одна особь, у которой генетический фрагмент A. roylei был короче, несла ген устойчивости к милдью, но потеряла летальный рецессивный ген (Scholten et al., 2007). На основе этого были созданы селекционные линии, гомозиготные по устойчивости к милдью, которые могли передавать устойчивость всем своим потомкам. Несколько компаний, выведших сорта лука, устойчивые к милдью, используют генетические маркеры для отслеживания встраивания гена устойчивости к Pd в свои селекционные линии. Это позволяет избежать трудоемкой оценки устойчивости к болезни на каждом этапе и представляет собой хороший пример селекции с использованием маркеров. Ожидается, что коммерческие сорта, устойчивые к мучнистой росе, появятся в 2008-2009 годах, примерно через 20 лет после первоначального выявления устойчивости у A .roylei (Scholten et al., 2007).

Существует потенциальная возможность введения устойчивости ко многим заболеваниям с помощью генетической трансформации (Eady, 2002). Встраивание генов вирусных белков в геномы растений обеспечило устойчивость к вирусным заболеваниям ряда культур. Определены последовательности ДНК, кодирующие белки оболочки карлавирусов и потивирусов аллиума — групп, включающих ряд серьезных заболеваний. Используя эту информацию, можно сконструировать и экспрессировать эти последовательности в аллиуме, чтобы вызвать устойчивость.

Многие патогены луковых грибов наносят вред растениям путем гифальной инвазии, и с этим можно бороться с помощью различных генов устойчивости. Некоторые из них были идентифицированы и показано, что они действуют путем предотвращения роста клеточных стенок грибов, ингибирования повреждающих растения ферментов, вырабатываемых вторгшимися грибами, или путем детоксикации грибковых токсинов. Примером последнего типа является ген, кодирующий фермент оксалиноксидазу, который вырабатывает фермент, расщепляющий грибковый токсин щавелевую кислоту до углекислого газа и перекиси водорода. Благодаря этому щавелевая кислота перестает снижать рН тканей, что, в свою очередь, препятствует эффективной работе патогенных ферментов грибов. Этот ген был введен в другие виды растений и обнаружил, что он подавляет грибковую инвазию. Теперь он был введен в лук с помощью трансформации, опосредованной Agrobacterium (Eady et al., 2005). Щелочная кислота — это токсин, вырабатываемый Sclerotium cepivorum, возбудителем белой гнили лука, когда он проникает в корни. Еще одна интригующая возможность предотвращения этого трудноизлечимого заболевания — использование методов «генного глушения» для «выключения» генов, ответственных за производство летучих соединений серы в корнях аллиума. Выделение этих веществ в почве стимулирует прорастание склероций Sclerotium cepivorum. Был идентифицирован специфический для корней фермент аллииназа, и, «заглушив» ген, кодирующий этот фермент, можно предотвратить выделение сигнала прорастания сернистых соединений для болезнетворного гриба, избежав тем самым заражения (Eady, 2002).

Интересным примером устойчивости к вредителям является устойчивость лука к Thrips tabaci, луковому трипсу, вероятно, самому сильному вредителю этой культуры во всем мире. Устойчивость была обнаружена у сорта с широким углом расхождения самых внутренних листьев, у которого последующие влагалища листьев вытягиваются за пределы более старых, которые их окружают. Вредитель обычно укрывается и размножается в щели между самыми молодыми листьями, поэтому такая морфологическая адаптация лишает его привычной среды обитания. Еще одно внешнее изменение, «глянцевая листва» — вызванное отсутствием воска на внешней стороне листа — придает трипсам устойчивость. Это обусловлено единственным рецессивным генным аллелем. Однако растения с этим признаком обладают повышенной восприимчивостью к пушистой росе и пурпурной пятнистости.

Это иллюстрирует еще одну общую проблему развития устойчивости. Иногда свойства, обеспечивающие устойчивость, могут повышать восприимчивость к другим вредителям или патогенам, как в последнем примере, а иногда они могут противоречить другим требованиям к культуре. Например, исследования устойчивости к нападению луковой мухи показали, что сорта лука, содержащие высокую концентрацию летучих соединений серы, были наиболее восприимчивы к нападению (Soni and Ellis, 1990). Муха обнаруживает лук по этим соединениям. Однако именно эти соединения придают луку аромат и остроту, поэтому можно предвидеть конфликт между устойчивостью к вредителям и потребностью в луке с сильным ароматом.

Трансгенные растения шалота и чеснока были сконструированы таким образом, чтобы быть устойчивыми к свекловичному армейскому червю Spodoptera exigua, важному тропическому вредителю. Устойчивые растения содержат токсичный для вредителя белок, который кодируется геном, полученным от Bacillus thuringiensis. Этот ген был включен в хромосомы аллиума с помощью опосредованной Agrobacterium генетической трансформации каллусных культур тканей шалота и чеснока. В результате были получены нормальные растения, содержащие новый белок, и показана их устойчивость к вредителю (Zheng et al., 2004, 2005).

Было разработано несколько лабораторных методик для испытания селекционных линий болезнями или вредными организмами и измерения степени восприимчивости или устойчивости. Например, Currah и Maude (1984) проверяли устойчивость к листовой гнили, вызванной B. squamosa, путем внесения стандартной дозы B. squamosa в маленькие диски листьев на влажной вате. Затем диски инкубировали при постоянной температуре 15 °C при 100% относительной влажности воздуха. Определялось среднее время появления нитей мицелия гриба на поверхности листового диска. Между сортами наблюдались значительные различия во времени развития инфекции. Используя такие «скрининговые тесты», можно стандартным способом проверить на устойчивость многие линии. Устойчивые линии, выявленные с помощью таких быстрых тестов, могут быть включены в более масштабные и более трудоемкие тесты на повышение устойчивости в полевых условиях. Сообщалось о скрининговых тестах на белую гниль лука, розовую корневую болезнь, шейковую гниль, луковую муху и другие (см. соответствующие главы в Rabinowitch and Brewster, 1990b).

Большая часть устойчивости к вредителям и болезням была получена путем массового отбора под давлением атак этих организмов. Это по-прежнему остается важной стратегией селекции, а устойчивость в полевых условиях является окончательной проверкой устойчивости, выработанной более сложными методами. Земляные сорта культурных аллиумов, которые были выведены в условиях всемирного разнообразия вредителей и болезней, вероятно, являются наиболее важным резервуаром генов устойчивости. Поэтому, как говорилось в главе 1, для будущей селекции устойчивости жизненно важно сохранить эти старые сорта (Astley, 1990).

Литература

Onions and other vegetable alliums / J.L. Brewster. — 2nd ed. США. 2008.

×
Русфонд