Основная страница: Перец
Каждый вид перца имеет свой уникальный набор характеристик, которые должны быть соблюдены, чтобы быть коммерчески приемлемыми. Селекционер, работающий, например, с болгарским перцем, будет иметь иные цели, чем селекционер, занимающийся выведением сорта паприки. Кроме того, необходимо учитывать конечное использование каждого вида перца. Зеленый спелый перец типа «Нью-Мексикан», предназначенный для продажи на свежем рынке, может иметь совершенно другие требования к садоводству по сравнению с перцем того же типа, выращенным для производства красного порошка.
Некоторыми характеристиками трудно манипулировать. Жгучесть — одна из таких характеристик, которую трудно стабилизировать. Производители, переработчики и потребители предъявляют очень специфические требования к ожидаемой жгучести для различных видов перца или продуктов из него. К сожалению, жгучесть — это характеристика, которая сильно изменяется под воздействием условий окружающей среды во время производства (Harvell and Bosland, 1997). Для того чтобы попытаться вывести культуру со стабильной жгучестью, необходимо сначала найти стабильные генотипы.
Поэтому перед селекционерами стоит множество задач, и для их решения они могут использовать несколько различных методов селекции. Однако сначала необходимо понять генетику перца и его репродуктивное поведение.
История исследований
Самыми первыми селекционерами перца были коренные народы Америки. Халапеньо, серрано, пасилья, анчо и другие виды перца были выведены со временем этими первыми селекционерами. Сегодня перед селекционерами перца стоит общая задача собрать в культиваре превосходные генетические элементы, необходимые для повышения урожайности, защиты от производственных рисков и улучшения качества. Конкретные цели этих селекционеров столь же многочисленны, как и многочисленные виды перца и их последующее использование.
Род Capsicum представляет собой один из нескольких хорошо охарактеризованных родов пасленовых. Для этого рода имеется множество классических и молекулярно-генетических исследований. Информация, полученная от его культивируемых родственников, томата и картофеля, позволила получить дополнительные сведения для фундаментальных и прикладных исследований. Босвелл (1937) провел обзор ранних генетических исследований Capsicum, начиная с исследований Веббера (1912) и Аткинса и Шеррарда (1915). Ранние классические генетические исследования были сосредоточены на легко оцениваемых морфологических признаках и перешли к экономически важным признакам культуры, связанным с производством. Липперт и др. (1965) впервые каталогизировали список из 50 известных генов Capsicum. Даскалов и Пулос (1994) и Ванг и Босланд (2006) составили обновленные списки генов. Цели селекции этой культуры сосредоточены на признаках плодов, включая урожайность, цвет, размер, форму, жгучесть, а также устойчивость к болезням плодов и листьев в открытом грунте и защищенном грунте. С конца 1980-х годов усилия по маркировке и картированию идентифицированных генов с помощью молекулярных методов позволили получить маркеры, связанные с важными признаками, для использования в программах селекции сладкого и острого перца с помощью маркеров. Используя картографические популяции, созданные в результате серии межвидовых скрещиваний, RFLP, AFLP1, RAPD и SSR маркеры были интегрированы для повышения средней плотности маркеров и облегчения идентификации просто наследуемых и сложных признаков.
Понимание рода Capsicum началось с самых первых селекционеров — коренных народов Америки. Это позволило им создать удивительное разнообразие форм, размеров и видов перца. Сегодняшним селекционерам перца необходимо глубокое понимание генетики этой культуры, чтобы продолжать ее совершенствование. Наше понимание вышло за рамки использования просто наследуемых, менделевских признаков и расширилось до сферы биотехнологии. Наше понимание генетики Capsicum, несомненно, будет расширяться по мере применения новейших и будущих методов биотехнологии и науки.
Виды и комплексы видов рода Capsicum
Род Capsicum произрастает в тропиках Центральной и Южной Америки. Пять одомашненных видов Capsicum включают C. annuum, C. frutescens, C. chinense, C. baccatum и C. pubescens. В Capsicum признаны три видовых комплекса, основанных на скрещиваемости видов (Tong and Bosland, 1999). Комплекс annuum состоит из культивируемых видов C. annuum, C. frutescens и C. chinense, а также диких видов C. chacoense и C. galapagoense. Комплекс baccatum состоит из культивируемого C. baccatum и диких видов C. praetermissum и C. tovarii. Комплекс pubescens является наиболее изолированной из трех групп и состоит из культивируемого C. pubescens и диких C. eximium и C. cardenasii. Половые скрещивания возможны с разной степенью сложности между видами внутри комплекса. Культивируемые и дикие формы Capsicum представляют собой богатейшие генетические ресурсы, в значительной степени неиспользованные для улучшения сельскохозяйственных культур.
Геном
Содержание ядерной ДНК у различных видов Capsicum, определенное методом проточной цитометрии, колеблется от 7,65 пг на ядро у C. annuum до 9,72 пг на ядро у C. pubescens (Belletti el al., 1995). Большинство видов перца диплоидны, имеют 24 хромосомы (2n=2x=24), одну или две пары акроцентрических хромосом с десятью или 11 парами метацентрических или субметацентрических хромосом (Lanteri and Pickersgill, 1993). Интересно, что C. annuum и C. chinense отличаются друг от друга посредством двух хромосомных смен (Tanksley and Iglesias-Olivas, 1984; Lanteri and Pickersgill, 1993). Для сравнения, геном томата (Solanum lycopersicum L.) составляет примерно четверть размера генома C. annuum (Arumuganatham and Earle, 1991).
Изменчивость хромосомного кариотипа не различает ботанические таксоны, но в пределах диких сортов она выше, чем у одомашненных сортов (Ohta, 1962). Транслокации очевидны между видами, а количество и расположение транслокаций связано с расстоянием между таксонами и гибридной фертильностью (Gonzalez de Leon, 1986; Pickersgill, 1991; Onus and Pickersgill, 2004). Гаплоидия у Capsicum встречается часто, от 1 на 1000 до 1 на 10000 растений (Pochard and de Vaulx, 1979). Диплоидизация может быть осуществлена путем нанесения колхицина на раненые точки роста. Pochard и de Vaulx (1979) описали пониженную фертильность и стабильность автодиплоидов по сравнению со стандартными инбредными линиями.
Список известных генов может быть очень полезен для селекционеров перца, особенно если имеется коллекция гермплазмы, содержащая репрезентативные образцы. В 1965 году Липперт и его коллеги составили список генов для перца (Lippert et al., 1965). Список включал 50 генов и стандартизацию правил именования и обозначения. Обновленный список генов был составлен Даскаловым и Пулосом (1994), а Ванг и Босланд (2006) представили еще одно обновление, добавив 92 ранее не зарегистрированных гена, доведя общее количество до 292. C. annuum cvs. ‘California Wonder’ и ‘Doux Lond des Landes’ описаны как нормальные или стандартные генотипы «дикого типа». Правила присвоения символов генов следующие. Гены обозначаются максимум тремя курсивными римскими буквами. Первая буква символа должна быть такой же, как и в названии гена, которое должно описывать характерную особенность мутантного типа в минимальном количестве прилагательных или существительных на английском или латинском языках. Первая буква символа должна быть заглавной только в том случае, если мутант является доминантным, все буквы символа должны быть написаны в нижнем регистре, если мутант является рецессивным. Символ гена может быть присвоен символу только в том случае, если он подтвержден статистически достоверными сегрегационными данными (из популяций F2 и беккросса). Множественные аллели, подтвержденные аллельными тестами, получают один и тот же символ, за которым следует надстрочный индекс из римских букв или арабских цифр. Мимики могут иметь либо отличительные названия и символы, либо тот же символ гена, за которым следует дефис и уникальная арабская цифра или римская буква. Модифицирующий ген может иметь либо символ соответствующего названия, например, интенсификатор, за которым следует дефис и символ аллеля, на который он влияет, либо отличительное название. Новые символы генов не должны присваиваться заранее назначенным символам. Аналогичным образом, один и тот же признак не должен описываться более чем одним символом. Если один и тот же символ был случайно присвоен разным генам или более одного символа было назначено для одного и того же гена или генов, приоритет в публикации должен быть основным критерием для определения предпочтительного символа.
Комитет по номенклатуре генов Capsicum и Eggplant Newsletter обратился к Комитету по номенклатуре генов Capsicum с просьбой предоставить образец семян каждого названного и принятого генофонда. Все генетические образцы должны быть переданы в генетический кооператив Capsicum в Университете штата Нью-Мексико в США. Дубликаты образцов должны храниться у оригинатора или в отдельном месте (CENL, 1994).
Несколько исследователей провели цитогенетические исследования, изучая хромосомную структуру. Pickersgill (1971) изучил кариотипические различия, а также географическое распространение, скрещиваемость и археологические данные, чтобы прояснить взаимоотношения между культивируемыми и дикими «сорными» видами Capsicum. Культивируемый C. annuum содержал две пары акроцентрических хромосом со спутниками на одной или обеих парах, тогда как сорные формы содержали только одну или редко две акроцентрические пары. У сорных форм кариотипы были гораздо более изменчивыми, чем у культурных, что позволило Пикерсгиллу предположить, что культурные формы были одомашнены относительно недавно из небольшой популяции дикого C. annuum и поэтому прошли через генетическое узкое место. Изменчивость кариотипа была также относительно высокой у диких форм C. baccatum, C. chinense и C. frutescens. Moscone (1990) провел кариотипический анализ двух популяций C. chacoense, а Moscone и др. (1993) использовали С-краску Гиемса для шести видов Capsicum, чтобы уточнить таксономическую группировку. Лантери и Пикерсгилл (1993) исследовали мейотические хромосомы Fx гибрида между C. annuum и C. chinense и подтвердили, что два образца различаются двумя хромосомными сменами, включающими три пары хромосом. Два года спустя Moscone et al. (1995) использовали окрашивание серебром активных нуклеолярно-организующих областей девяти видов Capsicum с целью получения дополнительных маркеров для идентификации хромосом.
Молекулярные карты сцепления
Внутривидовые скрещивания C. annuum x C. annuum, а также межвидовые скрещивания были успешно использованы для создания популяций для картирования, маркировки желательных локусов и построения карт сцепления на основе маркеров. Классическая карта сцепления C. annuum x C. chinense, разработанная Танксли и др. (1988), включала 85 картированных RFLP-маркеров. Последующие подробные карты популяций включают шесть внутривидовых карт C. annuum, пять дополнительных карт C. annuum x C. chinense и две молекулярные карты C. annuum x C. frutescens. Родительские линии, использованные для создания популяций для картирования, отражают их перекрестную совместимость и фертильность. Добавление маркеров RAPD, AFLP и SSR улучшило плотность маркеров этих последовательных карт сцепления (Prince et al., 1993; Livingstone et al., 1999; Ben Chaim et al., 2001b; Kang et al., 2001; Lefebvre et al., 2002; Rao et al., 2003; Lee et al., 2004). Недавно разработанные карты добавили маркеры SSR, CAP, SSAP, STS и набор консервативных ортологов (COS) в карты связей Capsicum (Minamiyama et al., 2006; Yi et al., 2006; Barchi et al., 2007; Wu et al., 2009).
Интегрированные молекулярно-маркерные карты перца были построены путем слияния внутривидовых и межвидовых карт. Paran et al. (2004) объединили четыре внутривидовые карты C. annuum и две межвидовые карты, созданные на основе C. annuum и C. chinense. Эта интегрированная карта включала 2262 маркера и улучшила плотность маркеров в среднем до одного маркера на 0,8 см3. Используя преимущественно однокопийные маркеры, Lee, H.R. et al. (2009) объединили две внутривидовые карты C. annuum и две межвидовые карты C. annuum x C. chinense. Интегрированная карта включала в общей сложности 1550 маркеров, состоящих из 169 SSR, 354 RFLP, 23 STS из BAC-концевых последовательностей, 6 STS из RFLP, 152 AFLP, 51 WRKY и 99 rRAMP маркеров на 12 хромосомах.
Наличие подробных молекулярных карт для перца и томата позволяет сравнивать структуру генома или синтению между этими родственными родами. Сравнительное картирование показало, что гены перца и томата сохраняются, но линейный порядок маркеров не сохраняется в группах сцепления между двумя геномами (Tanksley et al., 1988). Ливингстон и др. (1999) показали, что минимум 22 хромосомных разрыва ответственны за хромосомные транслокации и инверсии, наблюдаемые между геномами перца и томата. В соответствии со сравнительным картированием ядерного генома перца, последовательность хлоропластов перца обнаруживает высокую частоту тандемных повторов и крупных инсерций/делеций по сравнению с табачным, томатным и картофельным пластомом (Jo et al., 2011).
Применение биотехнологий
Достижения в применении биотехнологии для исследования и разведения перца происходят с поразительной скоростью. Биотехнологии используются для картирования геномов, оценки генетических ресурсов и выведения новых сортов. Генетическое картирование было описано в других разделах этой главы. Молекулярные маркеры используются для характеристики генетической структуры отдельных особей и популяций. Селекционеры также используют их в качестве инструментов в процессе селекции, используя селекцию с помощью маркеров. Генная инженерия и культура тканей не только позволяют создавать генетически модифицированные перцы, но и могут ускорить процесс выведения сортов.
Молекулярный анализ и селекция с помощью маркеров
Молекулярные маркеры оказались бесценными для понимания генетического состава сельскохозяйственных культур. Такие маркеры используют преимущества технологий, которые позволяют ученым и селекционерам наблюдать генетические различия между двумя или более особями. Молекулярные маркеры похожи на генетические маркеры. Генетические маркеры рассматриваются как морфологические различия, которые с начала 20 века используются для построения генетических карт (Patterson et al., 1991). Молекулярные маркеры отличаются от генетических несколькими способами:
- молекулярные маркеры обычно встречаются в большем количестве;
- молекулярные маркеры можно выделить, не полагаясь на полное развитие растения (т.е. можно анализировать ткань проростка, а не ждать, пока растение проявит какую-то морфологическую особенность);
- окружающая среда не изменяет экспрессию молекулярного маркера (Tanksley, 1983).
В целом, молекулярные маркеры обычно используются для изучения генетического разнообразия, систематики и филогении. Они используются в сочетании с другими маркерами для построения генетических карт и применяются в исследованиях сцепления. Маркеры, связанные с желаемым признаком, могут использоваться селекционерами в селекции с помощью маркеров (MAS). Когда маркеры идентифицируются с геном или генами, представляющими интерес, маркер(ы) может(ют) использоваться в качестве критерия отбора селекционерами (Staub et al., 1996). Отбор с помощью молекулярных маркеров устраняет необходимость в дорогостоящих и иногда неэффективных скринингах и ускоряет процесс выведения сортов.
Различные молекулярные маркеры уже используются в генетике и селекции перца, и тенденция к увеличению их использования будет продолжаться по мере разработки новых и более эффективных молекулярных маркеров.
Изозимы
Изозимы — это белковые молекулы, которые разделяются электрофоретически на основе их заряда. Гели окрашиваются на специфическую активность ферментов, и таким образом можно идентифицировать аллельные и неаллельные белки (Tanksley, 1983). Основным недостатком изозимного анализа является небольшое количество доступных изозимных локусов. Использование изозимов в исследованиях перца было направлено преимущественно на измерение генетической изменчивости и выяснение систематических и филогенетических отношений в роде Capsicum (McLeod et al., 1979,1983; Conciella and Saccardo, 1990; Loaiza-Figueroa, 1989; Tanksley, 1984b).
RFLPs
Полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (Restriction fragment length polymorphisms, RFLPs) используют рестрикционные ферменты, которые разрезают геномную ДНК в определенных местах. Разрезанные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза перед переносом и иммобилизацией на нитроцеллюлозную бумагу. Затем фрагменты зондируются, обычно с помощью клонированных, радиоактивно меченных фрагментов ДНК длиной 500-3000 пар оснований (Staub et al., 1996). RFLP-анализ позволяет отличить гомозиготные особи от гетерозиготных, но он дорог, требует технических знаний и имеет еще один недостаток — использование радиоактивного материала. В исследованиях Capsicum RFLPs использовались в основном для генетического картирования и изучения генетического разнообразия (Lefebvre etai., 1993; Prince etai., 1992,1994).
RAPD
В анализе случайно амплифицированной полиморфной ДНК (Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полиморфные маркеры генерируются с помощью одиночных праймеров, длина которых обычно составляет 10 пар оснований (Williams et al., 1990). Анализ RAPD использовался в исследованиях Capsicum для изучения генетического разнообразия и связи, а также для получения дополнительных молекулярных маркеров для картирования (рис. 5.1; Prince etal., 1994; Inai etal., 199 3; Lefebvre etal., 1997; Votava etal., 2002, 2005).
AFLP
Для анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (Amplified fragment length polymorphism, AFLP) используются рестрикционные ферменты, окисляющие геномную ДНК. Переваренные фрагменты лигируются к амплифицируемым адаптерам, амплифицируются с помощью праймеров ПЦР, а затем разделяются электрофоретически на гелях. Анализ AFLP позволяет одновременно выявлять полиморфизмы в различных геномных регионах и обладает высокой повторяемостью, что уже использовалось в исследованиях сцепления Capsicum, генетического разнообразия и генетического картирования (Paran etal., 1998; Lee etal., 2009).
Однонуклеотидный полиморфизм (Single nucleotide polymorphism, SNP) — это разница в последовательности ДНК, которая возникает при изменении одного нуклеотида (A, T, C или G) в геноме. Анализ SNP использовался в исследованиях и селекции перца, для идентификации видов, картирования и селекции с помощью маркеров (Jeong et al., 2010; Jung et al., 2010).
Опыление
Хотя растения перца обычно считаются самоопыляющейся культурой (Allard, 1960), частота ауткроссинга (перекрестного опыления), зафиксированная несколькими исследователями (2%-90%), указывает на то, что Capsicum следует считать факультативным перекрестноопыляющимся родом в полевых исследованиях (Odland and Porter, 1941; Franceschetti, 1971; Tanksley, 1984a; Kim et al., 2009). Такое перекрестное скрещивание, которое оказалось достаточным, чтобы помешать прогрессу в некоторых селекционных программах, связано с естественными насекомыми-опылителями, а не с дождем или ветром (Odland and Porter, 1941; Tanksley, 1984a). Количество перекрестного опыления влияет не только на меры предосторожности, необходимые для производства семян, но и на селекционные методики, используемые селекционерами, работающими над перцем. Естественные опылители, такие как насекомые, должны быть исключены, если необходимо обеспечить самоопыление. Муравьи часто упоминаются как опылители перца, но их вид деятельности, отсутствие густого волосяного покрова на теле и их ограниченное количество (по отношению к цветкам, присутствующим на коммерческих посадках) ставят под сомнение их способность к перекрестному опылению перца; медоносные пчелы и одиночные пчелы гораздо более склонны к перекрестному опылению перца.
У большинства видов Capsicum цветки являются полноценными и самосовместимыми. Самонесовместимость обнаружена у некоторых сортов C. pubescens и у диких видов C. cardenasii, C. buforum и C. flexuosum. Депрессия инбридинга не распространена у перца, хотя гетеротический эффект может проявляться у гибридов. Все виды являются протогинами и могут перекрестно опыляться. Рыльце может располагаться немного ниже уровня пыльников или выходить за их пределы, в этом случае шансы на перекрестное опыление выше.
Чтобы произвести большое количество генетически чистых семян, программы сертификации семян часто используют географическую изоляцию для предотвращения нежелательного перекрестного опыления (NMCIA, 1992). В этих программах интересующая семенная культура Capsicum не должна выращиваться в пределах 0,25 мили (около 0,4 км; если семена должны быть отнесены к классу «сертифицированных») или 1 мили (около 1,6 км; если семена должны быть отнесены к классу «фундаментальных») от любых других растений Capsicum. В селекционных программах, поскольку многочисленные селекционные линии и растения должны быть изолированы во время производства семян, пространство для такой изоляции часто становится ограниченным. Чтобы обеспечить самоопыление в ограниченном пространстве, Босланд (1993) разработал простую изоляционную клетку для исключения опыляющих насекомых из растений (рис.). Клетка состоит из нейлоновой сетки, натянутой на каркас, изготовленный из трубы. Были успешно использованы как зеленые, так и белые сетки. В климатических условиях южной части Нью-Мексико ни один из цветов не повлиял на рост растений, плодоношение или производство семян. Используемая сетка, имеющая около восьми отверстий см в направлении основы и около шести отверстий см вдоль утка, эффективно предотвращает проникновение опыляющих насекомых в клетку, не требует закрепления клеток почвой и, несмотря на сильные ветры в Нью-Мексико, края сетчатой ткани у основания клетки достаточно тяжелые, чтобы лежать на земле без насыпания на них почвы. В конце каждого сельскохозяйственного сезона каждую клетку моют и хранят для следующего сезона.
К сожалению, изоляционная клетка, исключая перекрестное опыление, одновременно исключает естественных полезных насекомых, которые контролируют мелкую тлю (Myzus spp.), являющуюся основным вредителем, находящимся внутри клетки. Химические инсектициды, распыляемые через ткань, помогают бороться с тлей, а биоконтроль с помощью божьих коровок (Hippodamia convergens Guerin), помещенных в клетки (из расчета 75-100 божьих коровок на клетку, добавленных в момент установки клеток над растениями перца), также был признан эффективным в борьбе с тлей (Votava and Bosland, 1997). Если в течение вегетационного периода под клетками появляются гусеницы, используется обработка Bacillus thuringiensis, без видимого вреда для растений и божьих коровок.
Методы селекции
Для получения новых сортов перца можно использовать различные методы селекции. Используемые методы выбираются селекционером в соответствии с целями селекционной программы.
Массовый отбор
Первые селекционеры перца, коренные народы тропической Америки, одомашнили пять различных видов Capsicum в пяти различных событиях и местах одомашнивания. Эти первые селекционеры перца использовали метод массового отбора, при котором семена лучших растений сохранялись для следующего вегетационного сезона. Отбирались растения, лучше всего приспособленные к определенной географической зоне, и в результате были выведены тысячи наземных рас. После путешествия Колумба перец быстро распространился по всему миру, и снова были сформированы наземные расы, которые заполнили специфические культурные и экологические ниши. Сегодня эти наземные расы являются источниками генетически разнообразной зародышевой плазмы.
Метод родословной
Метод родословной предполагает ведение записей о скрещиваниях и их потомстве. Это включает в себя отбор отдельных растений и самоопыление. Родословная последующих самоопыленных поколений записывается в сочетании с отбором по желаемым признакам. Эта система позволяет получать однородные линии (Fehr, 1993). ‘NuMex Joe E. Parker’ является примером сорта, выведенного этим методом (Bosland et al., 1993). Он возник как отбор одного растения с поля, засеянного открыто опыляемой популяцией ‘New Mexico 6-4’. Впоследствии в течение трех поколений в тепличных условиях следовали протоколу племенного отбора. Каждая полученная линия затем была оценена по более чем 25 садоводческим признакам.
Беккросс
Метод беккросса использует успешный сорт в качестве повторного родителя, после первоначального скрещивания между этим успешным сортом и отдельной особью, которая служит в качестве родителя-донора для данного желаемого признака. После последовательных обратных скрещиваний с повторяющимся родителем селекционер получает культуру, которая почти идентична повторяющемуся родителю, но содержит дополнительный желаемый признак от родителя-донора. Метод беккросса успешен только при попытке интрогрессии признака, контролируемого одним или, самое большее, несколькими генами. Примером успешного сорта перца, выведенного методом беккросса, является ‘Greenleaf Tabasco’. В 1950 году Уолтер Гринлиф гибридизировал перец Табаско с сортом C. chinense, который был устойчив к вирусу табачного увядания (TEV). При третьем беккроссе Гринлиф провел гибридизацию со вторым донорским родителем C. chinense, устойчивым к TEV. Рецессивный способ наследования устойчивости к TEV требовал проведения скрининга в последующих поколениях. В 1970 году, после нескольких беккроссов, был выведен сорт ‘Greenleaf Tabasco’ (Greenleaf, 1986).
Повторяющийся отбор
Повторяющийся отбор — это метод селекции, который включает отбор отдельных растений из популяции с последующим скрещиванием для формирования новой популяции. Цель этой системы — получение трансгрессивных сегрегантов: особей, обладающих большей устойчивостью в результате генетической сегрегации, возникающей при скрещивании родителей, уже имеющих определенную степень устойчивости (Palloix et al., 1990a). Современные усилия, использующие этот метод для селекции перца, направлены на создание сортов перца, устойчивых к Verticillium dahliae и Phytophthora capsici (Palloix et al., 1990a, b).
Мутационная селекция
Мутационная селекция — это способ, с помощью которого в перце создаются мутации либо для улучшения экономически важных признаков, либо для устранения вредоносных признаков. Хотя это не основной метод селекции, он может быть средством получения новых мутантов, представляющих интерес. Мутации могут быть индуцированы ионизирующим излучением или химическим путем. Затем интересующие мутации могут быть включены в коммерчески приемлемые линии с помощью традиционных методов селекции, таких как описанные выше. Бхаргава и Умалкар (1989) использовали гамма-излучение и химические мутагены для получения целого ряда мутаций околоплодника. Alcantara и др. (1996) описали оптимальные условия, необходимые для мутагенеза семян C. annuum, когда в качестве мутагена использовался этилметансульфонат (EMS).
Гибридизация
Селекционер переносит пыльцу с пыльника одного цветка на рыльце другого для проведения контролируемой гибридизации. Также важно контролировать опыление при производстве гибридных семян поколения F1, продаваемых для коммерческого производства культуры. Перцы, выращенные из таких гибридных семян, отличаются высокой однородностью и обычно более высокой урожайностью, чем оба родителя.
Контролируемая гибридизация
Чтобы провести контролируемую гибридизацию, селекционер должен перенести пыльцу с пыльника одного растения на рыльце другого. Для предотвращения самоопыления выбирают нераскрывшиеся цветочные бутоны. С помощью простерилизованных спиртом щипцов лепестки аккуратно удаляются, чтобы обнажить репродуктивные органы. Затем цветок опустошают, удаляя все пыльники. Затем рыльце осматривают на предмет «загрязнения» пыльцой перед проведением контролируемого скрещивания. Пыльцу собирают с открытого цветка самца, или донора пыльцы, с помощью маленькой кисточки, пчелиной палочки или путем удаления пыльников. Пыльца переносится на рыльце эмаскулированного женского растения. Гибридизация маркируется, и после созревания плодов собирают семена.
Производство гибридных семян
Гибридные семена — это семена поколения F1, продаваемые для коммерческого производства культуры.
Производство гибридных семян стало более эффективным после документирования мужской стерильности у C. annuum Мартином и Гроуфордом в 1951 году и Петерсоном в 1958 году (Shifriss, 1996). При использовании межвидовой гибридизации мужская стерильность может возникать из-за хромосомной или плазмонно-геномной несовместимости. С помощью методов обратного скрещивания было получено безмужнее потомство. Однако для производства гибридных семян обычно используются генные msms. Мутанты одного гена ms найдены или индуцированы с помощью мутагенеза, и поэтому могут быть использованы для производства гибридных семян.
Большинство современных сорта Capsicum являются гибридами. Перцы, выращенные из гибридных семян, отличаются высокой однородностью и, как правило, относительно высокой урожайностью. Существует несколько систем производства гибридных семян, включая использование растений с генетической или цитоплазматической мужской стерильностью. К сожалению, производство современных гибридов перца обычно зависит от проведения гибридизации между двумя родителями вручную, что является очень трудоемким и дорогостоящим процессом.
Системы CMS (цитоплазматическая мужская стерильность) и GMS (генная мужская стерильность) присутствуют в перце и используются в селекционных программах, особенно для сортов перца чили.
Опыление может быть механическим (руками) или естественным (медоносными пчелами и шмелями). Данные показали, что максимальный урожай семян гибрида F1 достигается при соотношении мужских стерильных и мужских фертильных растений 1:1. Однако урожай семян гибридов F1 составляет менее половины от традиционных мужских фертильных растений (Shifriss, 1996).
В Китае гибридные семена получают путем выращивания большого количества мужских родительских растений, ручного сбора бутонов до осыпания пыльцы, сушки при комнатной температуре, а затем просеивания пыльцы до однородного размера (Xuexiao, 2001). Опыление производится на женские растения, которые были эмаскулированы накануне, что, как правило, обеспечивает максимальное производство семян. Зрелые плоды собирают, сушат в течение суток, а семена собирают и сушат в деревянных рамах, переплетенных ватой. Затем семена подготавливают к хранению.
По мере развития семян перца на качество семян влияет обеспеченность материнского растения питательными веществами (Xu et al., 2002), зрелость плодов, способы хранения и созревания (Osman et al., 1984; Sanchez et al., 1993a) и размер растений (Sanchez et al., 1993b). Повышенная концентрация калия в свежих плодах приводит к тому, что семена имеют большую всхожесть, чем семена, выращенные в условиях дефицита калия (Xu et al., 2002). Варьирование других питательных веществ и форм поглощения (нитрат против аммония) приводит к колебаниям других питательных веществ, состава аминокислот и жирных кислот. Производство семян напрямую связано с размером растений, так как более крупные растения производят семена, которые прорастают быстрее и имеют больший процент всхожести (Sanchez et al., 1993a). При производстве семян перца низкая плотность растений приводит к появлению более крупных растений с большей площадью листьев, которые могут производить больше фотоассимилятов для развивающихся семян. Плоды из нижней части растения дают семена с большим сухим весом и лучшими характеристиками всхожести (Osman et al., 1984). Качественное производство семян имеет важное значение для поддержания стабильных посадок перца.
Генетическая мужская стерильность
Генетическая мужская стерильность (GMS) — это один из способов получения гибридных семян. Стерильные растения используются в качестве женского родителя в гибридном скрещивании. Признак мужской стерильности часто наследуется как единственный рецессивный ген, ms. Использование генетической мужской стерильности в производстве гибридных семян ограничено из-за неэффективности производства и поддержания популяции мужских стерильных растений. Для того чтобы получить больше мужских стерильных растений, необходимо гибридизировать фертильное растение, гетерозиготное по признаку мужской стерильности, с мужским стерильным растением, и тогда только половина потомства от этой гибридизации будет проявлять мужскую стерильность.
Мужская стерильность у перцев была подробно изучена Шифриссом и другими. В 1960-х годах Шифрисс и Френкель (1969) обнаружили генетически мужское стерильное растение в популяции сорта All Big’, болгарского перца. Они определили, что стерильность кодируется одним рецессивным геном. Авторы также отметили, что мужская стерильность сопровождалась развитием партенокарпических плодов в течение всего вегетационного периода.
Несколько лет спустя Шифрисс и Рыльский (1972) описали обнаружение второго гена, кодирующего генетическую мужскую стерильность, в популяции болгарского перца ‘California Wonder’. И снова этот признак был унаследован как единственный рецессивный ген. Шифрисс и Рыльский (1972) предложили назвать ген, описанный Шифриссом и Френкелем (1969), ms-1, а их неаллельный ген — ms-2.
Системы GMS в перце стабильны, но имеют тот недостаток, что для различения гомозиготных (MsMs) и гетерозиготных (Msms) мужских фертильных растений в производстве гибридных линий необходимы тестовые скрещивания, а половина материнских растений всегда мужски фертильна и должна быть удалена (Lee, J. et al., 2009). Поэтому усилия были направлены на обнаружение маркеров, связанных с рецессивным признаком (ms). Было описано около 20 рецессивных и доминантных генов для мужской стерильности, которые включают как спонтанные, так и индуцированные мутанты (Wang and Bosland, 2006).
Пытаясь увеличить соотношение мужских стерильных растений в популяции, Шифрисс и Пиловский (1993) провели гибридизацию двух изогенных линий, различающихся по генам мужской стерильности. Целью этой дигенной гибридизации было получение мужского стерильного растения, содержащего как ms-1, так и ms-2. Такое растение затем гибридизировали с фертильным растением, гетерозиготным по обоим генам (т.е. ms1ms1ms2ms2 x Ms1ms1Ms2ms2). Полученное потомство сегрегировало в соотношении три мужских стерильных растения к одному фертильному. Следствием этого было то, что для такой гибридизации необходимо было удалить только четверть растений с поля для производства семян. К сожалению, эта процедура требовала, чтобы оба родителя поддерживались бесполым путем и были защищены от вирусного заражения (Shifriss, 1997). Семеноводческие компании адаптировали генетическую систему мужской стерильности для производства гибридных семян (Lee et al., 2010), а возможность идентифицировать ядерные гены, ответственные за стерильность, делает их использование еще более эффективным. Lee et al. (2010) определили маркеры полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP), которые были связаны с другим геном мужской стерильности, ms3. Затем они преобразовали один из AFLP-маркеров в маркер усиленной расщеплением полиморфной последовательности (CAPS), который можно легко использовать в селекционных программах, которые полагаются на генетическую мужскую стерильность как часть своих протоколов.
Внедрение генетически контролируемой системы мужской стерильности имеет большую экономическую ценность, поскольку устраняет необходимость в трудоемких ручных эмаскуляциях.
Среди множества существующих вариантов GMS, линии GMS GMS1, GMS3 и GMSK используются в коммерческом производстве гибридов чили (Lee, J. et al., 2009). Эти мутанты могут иметь нормальную структуру пыльников со смесью фертильной и стерильной пыльцы, аномальные пыльники с нежизнеспособной пыльцой или андроэций, дающий петалоидную структуру. Lee, J. et al. (2009) разработали CAPS-маркер, связанный с мужской стерильностью в GMS3 (ms3), SCAR-маркер, сцепленный с GMS1 (ffisj (Lee, J. et al., 2010), и CAPS-маркер, расположенный на расстоянии 2-3 сМ от локуса ms у сладкого перца (Lee, J. et al., 2009).
Цитоплазматическая мужская стерильность
Цитоплазматическая мужская стерильность (CMS) — это еще один способ получения гибридов. Преимущество системы CMS заключается в том, что можно создать популяцию стерильных растений, в которой все потомство будет стерильным. Использование CMS затруднено из-за нестабильности при низких температурах и неполной восстанавливаемости (Shifriss and Guri, 1979; Shifriss, 1997; Lee, J. et al., 2008a, 2009; Min et al., 2008; Gniffke et al., 2009).
Стерильность возникает в результате взаимодействия ядерных и цитоплазматических факторов. Хотя Петерсон (1958) описал цитоплазматическую мужскую стерильную систему, эта система была нестабильной и приводила к фертильной пыльце в прохладных условиях. Исследования с использованием материала CMS Петерсона впоследствии показали, что дополнительные факторы влияют на стерильность и стабильность пыльцы (Novak et al., 1971; Shifriss and Frankel, 1971; Shifriss and Guri, 1979). Использование CMS для создания F1 гибридов нашло коммерческое применение, прежде всего в Корее (Gulyas et al., 2006; Gniffke et al., 2009).
Ким и др. (2007) удалось трансформировать арабидопсис конструкцией гена orf456, нацеленной на митохондрии, из CMS-линий перца. Значительная часть трансформированных растений проявила стерильный фенотип, что указывает на то, что этот ген отвечает за CMS у Capsicum.
В течение последнего десятилетия большое количество исследований было посвящено CMS и ее восстановлению. Молекулярные маркеры были связаны как с митохондриальным источником стерильности, так и с ядерным геном, связанным с восстановлением фертильности (Lee et al., 2008; Jo et al., 2009; Min et al., 2009).
Считается, что восстановление фертильности контролируется одним доминантным геном (Peterson, 1958; Gulyas et al., 2006; Min et al., 2009). На основе взаимодействия признака с окружающей средой были предложены более сложные модели наследования, в которых основной ген Rf действует в сочетании с несколькими генами-модификаторами (Peterson, 1958; Novak, 1971). Wang et al. (2004) сообщили о четырех минорных QTL в дополнение к основному QTL для восстановления фертильности на хромосоме P6. В основном локусе доминантный Rf восстанавливает фертильность в стерильной цитоплазме, а рецессивный rf сохраняет стерильность. Также был обнаружен третий аллель (Rfls7701′), который может быть как доминантным, так и рецессивным (Min et al., 2008). Этот аллель показал ассоциацию с нестабильностью МС, но был исключен как фактор, вызывающий нестабильность (Min et al., 2009). Использование молекулярных маркеров, связанных с восстановлением фертильности, значительно облегчает создание гибридов, поскольку можно избежать трудоемких тест-скрещиваний. Среди маркеров, связанных с Rf, были RAPD-маркеры (Zhang et al., 2000), CAPS-маркеры (Kim et al., 2006; Lee, J. et al., 2008b; Min et al., 2009), SCAR-маркеры (Jo et al., 2010) и STS-маркеры (Lee, J. et al., 2009).
CMS возникает из новых, рекомбинированных ORFs в митохондриальном геноме (Kim et al., 2007). Было выявлено несколько митохондриальных генов-кандидатов, связанных с CMS: регионы coxll и atp6-2 (Kim et al., 2001), а также ген orf456 (Kim et al., 2007, Gulyas et al., 2010). Были разработаны SCAR-маркеры, связанные с мужской стерильной цитоплазмой (Kim and Kim, 2005). Однако практическое использование молекулярных маркеров в гибридной селекции было ограничено из-за сбоев в работе маркеров в расходящейся зародышевой плазме (Min et al., 2008). Джо и др. (2009) описали специфичный для CMS маркер accD-U, разработанный на основе митохондриальной последовательности, полученной из хлоропластов, который более надежно определяет цитоплазму CMS у перца.
Межвидовая гибридизация
Гибридизация между видами Capsicum важна для интрогрессии генов устойчивости к болезням (например, интрогрессия устойчивости к вирусу табачной протравы от C. chinense к ‘Tabasco’ (C. frutescens)) и других уникальных признаков, присущих этому роду. Межвидовые гибриды различной фертильности были получены в большинстве комбинаций для C. annuum, C. baccatum, C. frutescens и C. chinense (Bosland and Votava, 1999). Гибридная стерильность, возникающая в результате смены хромосом, является основным механизмом репродуктивной изоляции у Capsicum. Capsicum pubescens генетически изолирован от других культивируемых видов. Многочисленные гибриды также были получены между дикими и культурными видами Capsicum.
Введение устойчивости к болезням в C. annuum от родственных видов Capsicum представляет собой одно из наиболее успешных применений межвидовой гибридизации в пределах рода для улучшения сельскохозяйственных культур. Capsicum chacoense обеспечил устойчивость к бактериальной листовой пятнистости (Bs-2, Hibberd et al., 1987). Capsicum frutescens и C. chacoense дали гены устойчивости к TMV (L1, Boukema и др., 1980; L4, Boukema, 1984). Capsicum chinense был источником генов устойчивости к TMV (L3, Boukema, 1980), а также TSWV (Tsw, Boiteux и de Avila, 1994) и геминивирусу (Garcia- Neria и Rivera-Bustamante, 2011).
Селекция на устойчивость к болезням и вредителям
Для обеспечения здорового и прибыльного урожая перца применяются культурные методы и пестициды. Одним из самых безопасных и эффективных способов защиты перца является выведение сортов, устойчивых к болезням и вредителям. Членистоногие, нематоды и патогены являются ограничивающими факторами продуктивности перца (Sarath Babu et al., 2011). Обширное генетическое разнообразие существует у одомашненных и диких видов Capsicum для создания устойчивых к вредителям и болезням сортов.
Интрогрессия устойчивости при сохранении приемлемых для садоводства характеристик — трудоемкая задача. Поэтому может потребоваться много лет, чтобы вывести устойчивый сорт, и эта задача становится еще более сложной и трудоемкой, если генетическая природа устойчивости количественная, контролируемая многими генами.
Успешные сорта были выведены против широкого спектра вредителей и патогенов. В настоящее время имеются сорта, устойчивые к нематодам, вирусам, грибкам и/или бактериям. Несколько сортов перца обладают множественной устойчивостью к болезням. Поскольку устойчивость к вредителям и болезням может быть преодолена определенным вредителем или патогеном, селекционеры постоянно выводят новые сорта перца с повышенной устойчивостью. Источники устойчивости, которые могут использовать селекционеры, включают в себя устойчивые сорта, наземные расы, диких родственников и близкородственные виды. Селекционеры предпочитают использовать источники устойчивости, которые существуют в зародышевой плазме, сходной с той, что имеется у выводимых сортов. Если такая внутривидовая гибридизация может быть использована, то для получения культурного сорта с приемлемыми для садоводства признаками, включая желаемую устойчивость к вредителям или болезням, потребуется меньше времени, чем при межвидовой гибридизации.
Устойчивость к болезням
Селекция на устойчивость к болезням является одной из основных целей селекции перца. Наличие элитных сортов перца, устойчивых к распространенным бактериальным, грибковым и вирусным патогенам, свидетельствует об успехе, достигнутом селекционерами в создании устойчивой зародышевой плазмы для использования на свежем рынке и в переработке. Коллинеарность картированных генов часто очевидна между родственными пасленовыми культурами. Попытки продемонстрировать коллинеарность картированных локусов устойчивости к болезням перца с локусами томата и картофеля выявили синтению между геном pot-1, обеспечивающим устойчивость к каливирусу у томата, и локусом pur-1 у перца (Parrella et al., 2002). В отличие от этого, гены устойчивости к TMV у перца (L) и томата (Tm-1, Tm-2) не картируются с синтеничными регионами (Lefebvre et al., 1995). Другие примеры синтенических и несинтенических геномных регионов были рассмотрены (Djian-Caporalino et al., 2007a).
Бактериальные заболевания
Бактериальная пятнистость, вызываемая Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, является наиболее серьезным бактериальным заболеванием, поражающим перец. Возникновение, по крайней мере, семи рас бактериальной пятнистости требует объединения генов устойчивости, где преобладают несколько рас патогена (Sahin and Miller, 1996). Было выявлено четыре доминантных гена устойчивости к бактериальной пятнистости (Таблица 3.5). Для генов устойчивости к бактериальной пятнистости Bs-2 и Bs-3 были разработаны маркеры на основе генов (Pierre et al., 2000; Roemer et al., 2010; Truong et al., 2011). Были охарактеризованы два рецессивных гена устойчивости к бактериальной пятнистости, которые обуславливают характерный негиперчувствительный ответ (Jones et al., 2002; Vallejos et al., 2010). Эти рецессивные гены обуславливают устойчивость ко всем описанным расам бактериальной пятнистости и обещают упростить селекцию на устойчивость там, где распространены многочисленные расы патогена.
Бактериальное увядание перца вызывается Ralstonia solanacearum. Высокие уровни устойчивости к бактериальному увяданию были описаны у зародышей C. chinense, C. frutescens и примитивной зародышевой плазмы C. annuum (Greenleaf, 1986). Генетическая устойчивость к патогену остается наиболее эффективной стратегией борьбы с этим заболеванием. Устойчивость хозяина часто преодолевается различиями между штаммами патогена. Используя штаммы патогена, представляющие генетическое разнообразие, описанное для патогена, Lebeau и др. (2011) описали реакции высоковосприимчивого и высокоустойчивого хозяина с промежуточными фенотипами, обусловленными способностью растений переносить скрытые инфекции. Усилия по селекции на устойчивость к бактериям были ограничены селекцией на устойчивость или толерантность к эндемичным штаммам патогена. Указывая на сложность выведения устойчивых сортов, Лафортун и др. (2005) выявили от двух до пяти высоконаследственных генов с аддитивным эффектом, которые контролируют устойчивость. Устойчивость была связана с восприимчивостью к TMV и нематодам.
Бактериальная плодовая гниль стручков перца обычно объясняется бактериальной мягкой гнилью, вызываемой Erwinia carotovora и E. atroseptica. Надежная идентификация устойчивости к мягкой гнили в зародышевой плазме перца была затруднена (Bartz and Stall, 1974; Stommel et al., 1996). Ориентация плодов в вертикальном положении у мелкоплодных идеотипов предотвращает задержку влаги в чашечке плода и продлевает условия без влаги, тем самым ограничивая проблемы плодовой гнили.
Грибковые заболевания
Грибки являются одной из самых больших групп организмов, вызывающих болезни перца. В полевых условиях фитофтороз, вызываемый Phytopthora capsici, широко распространен и может возникать на любой стадии роста, заражая все части растения. Наследование устойчивости к P. capsici носит сложный характер, а устойчивость хозяина к нему осложняется появлением нескольких рас патогена (Glosier et al., 2008; Monroy-Barbosa and Bosland, 2008; Sy et al., 2008). Ранние исследования выявили частичную генетическую устойчивость к P. capsici у Capsicum (Kimble and Grogan, 1960; Pochard and Chambonnet, 1971). Высокоустойчивый сорт C. annuum Criollo de Morelos-334 (CM334) демонстрирует высокую степень устойчивости к Phytopthora и был использован в многочисленных генетических исследованиях устойчивости. Показателем специфичности устойчивости к фитофторозу является то, что при массовом скрининге 2301 сорта C. annuum, Candole et al. (2010) выделили два сорта с высоким уровнем устойчивости к корневой гнили для использования при создании новых сортов с устойчивостью к местным изолятам патогена. Частичная и полигенная устойчивость была охарактеризована и интрогрессирована в адаптированную зародышевую плазму. Выявлены отдельные QTL, связанные с устойчивостью к P. capsici (Lefebvre and Palloix, 1996; Thabuis et al., 2003; Ogundiwin et al., 2005; Quirin el al., 2005; Kim et al., 2008). QTLs на хромосомах 5 и 10 были обнаружены чаще всего у устойчивых растений, происходящих из разных популяций, полученных от различных скрещиваний восприимчивых и устойчивых растений. Дополнительные QTL, представляющие 18 хромосомных регионов, были популяционно специфичными. Используя профилирование корневого транскриптома, Richins и др. (2010) идентифицировали 22 гена из C. annuum, которые были уникально выражены только в устойчивых к P. capsici линиях ‘CM334’ и ’01-1688/, таким образом, представляя перспективные гены-кандидаты для потенциального использования в селекции устойчивости.
Мучнистая роса, вызываемая Leveillula taurica, редко встречается в холодном климате, но широко распространена в теплом климате и теплицах. Фунгициды и имеющиеся устойчивые сорта обеспечивают адекватную борьбу с мучнистой росой. Различные уровни устойчивости к мучнистой росе были отмечены у C. baccatum var. microcarpum, C. baccatum var. pendulum, C. pubescens и C. annuum (Ullasa et al., 1981). Используя удвоенные гаплоиды для выявления QTL устойчивости к мучнистой росе, Лефевр и др. (2003) описали семь геномных регионов, включающих аддитивные QTL, в том числе основной QTL на хромосоме 6, и эпистатические взаимодействия, на которые приходится большая часть генотипической дисперсии устойчивости.
Возникновение гнили спелых плодов, вызываемой рядом видов Colletotrichum, усиливается при верхнем орошении и дождевых условиях. Устойчивость к вызванной Colletotrichum спелой гнили была зарегистрирована в различных коллекциях гермплазмы Capsicum (Ullasa et al., 1981; Kim, J.-S. et al., 2010). В межвидовой популяции C. annuum x C. chinense был выявлен один главный QTL (Bl) и три второстепенных QTL для устойчивости к антракнозной гнили плодов (Voorips et al., 2004). Используя внутривидовую популяцию C. baccatum, Махасук и др. (2009) описали один рецессивный ген (co4), который обуславливает устойчивость в зеленых незрелых плодах, и независимо наследуемый доминантный ген (Co5), который обуславливает устойчивость в зрелых стручках. Оба гена отличаются от генов устойчивости col и co2, идентифицированных у C. chinense. Kim, S. et al. (2010) определили два основных QTLs и 16 второстепенных QTLs, влияющих на устойчивость к антракнозной плодовой гнили во внутривидовой популяции C. baccatum.
Почвенные грибковые патогены, вызывающие засыхание или корневые гнили, включают Rhizoctonia solani, Pusarium spp. и Pythium spp. Эти патогены могут быть проблематичными при ранних посадках на грядках в условиях прохладной почвы. Были выявлены сорта, устойчивые к R/wzoctoHM (Muhyi and Bosland, 1995).
Вирусные заболевания
Вирусы вызывают наиболее серьезные проблемы с болезнями перца в регионах, где давление болезней велико. Более 20 вирусов, представляющих 15 таксономических групп, были идентифицированы как возбудители повреждений урожая перца. Типичные симптомы вирусов включают листовую мозаику, скручивание листьев, деформацию и задержку роста. Несмотря на широкое использование просто наследуемой устойчивости хозяина, интенсивное выращивание устойчивых сортов в районах с высоким давлением болезней способствует появлению устойчивых вирусных штаммов. Во многих случаях было выявлено несколько альтернативных основных генов устойчивости. Необходимо рассмотреть альтернативные источники полигенной устойчивости или устойчивости, опосредованной трансгенами.
Вирус табачной мозаики (TMV) — это тобамо-вирус, легко передающийся при абразивном контакте. Серия доминантных аллелей L обеспечивает устойчивость, но могут быть задействованы еще два фактора (Holmes, 1937; Boukema, 1980). L1 был картирован в C. annuum на хромосоме 11 (Lefebvre et al., 1995; Ben Chaim et al., 2001a). L4 из C. chacoense был картирован в 1,5 сМ от L (Matsunaga et al., 2003). Вариант TMV, Самсунский латентный штамм TMV (SLTMV), преодолевает гены устойчивости TMV и состоит из ряда штаммов, которые затрудняют селекцию на устойчивость (Boukema, 1980). Тобамовирусы томатной мозаики (ToMV) и вирус мягкой крапчатости перца (PMMoV) также заражают перец и могут контролироваться с помощью интрогрессии гена L и надлежащей санитарной практики.
Потивирусы картофельного вируса Y (PVY) и вируса табачного увядания (TEV) распространены по всему миру. В США они чаще встречаются в южных районах производства, но спорадические вспышки происходят и в других местах. Посадка сортов, устойчивых к PVY, обычно помогает контролировать TEV, поскольку устойчивость к обоим вирусам тесно связана. Существует несколько штаммов TEV, которые могут заражать сорта, устойчивые к PVY (Muhyi et al., 1994).
Было выявлено множество локусов устойчивости к каливирусам. Описаны молекулярные маркеры для моногенных и количественных типов устойчивости хозяина к PVY (Caranta et al., 1997a; Arnedo-Andres et al., 2002). Локус pvr-1 расположен на хромосоме 4 и кодирует эукариотический фактор инициации трансляции eIF4E (Murphy et al., 1998; Ruffel et al., 2004; Kang et al., 2005). Естественно возникающие точечные мутации в этом локусе приводят к моногенной рецессивной устойчивости к каливирусам широкого спектра действия. Локус pvr-5 аналогично сопоставляется с этим регионом на хромосоме 4. Локус pvr-6, вероятно, также представляет собой фактор инициации трансляции и картируется на хромосоме 3 (Caranta et al., 1996; Kang et al., 2005). Два доминантных гена устойчивости к каливирусам, Pvr-4 и Pvr-7, были картированы на хромосому 10 (Caranta et al., 1999; Grube et al., 2000; Arnedo-Andres et al., 2002). Kim et al. (2011) недавно обнаружили, что плотность стебля трихома может быть использована в качестве морфологического маркера для Pvr-4. Усилия по выявлению QTLs, связанных с устойчивостью к каливирусу, выявили множество QTLs, большинство из которых имели незначительный эффект и были специфичны для штамма вируса (Caranta et al., 1997a). QTL с основным эффектом, вероятно, соответствует pvr-1.
Для ограничения распространения вируса огуречной мозаики (CMV), вируса мозаики люцерны и мягкой крапчатости перца очень важно использовать имеющиеся устойчивые сорта и бороться с тлей. Были выявлены QTL, связанные с устойчивостью к CMV (Caranta et al., 1997b, 2002; Ben Chaim et al., 2001a). QTLs с основными эффектами и дигенными взаимодействиями были идентифицированы во всех трех исследованиях с незначительным сохранением положения маркеров в разных исследованиях.
Подобно контролю CMV, устойчивость хозяина и борьба с насекомыми ограничивают тяжесть вируса геми-нивируса курчавости верхушки свеклы (BCTV), передаваемого кузнечиками, и вируса пятнистого увядания томата (TSWV), передаваемого трипсами. Была выявлена генетическая устойчивость к BCTV (Ungs et al., 1977; Bosland, 2000). Недавно у C. chinense была выявлена устойчивость к геминивирусам вируса золотистой мозаики перца (PepGMV) и вируса желтой жилки перца Хуастеко (PHYVV) (Garcia-Neria and Rivera- Bustamante, 2011).
Тосповирус пятнистого увядания томатов (TSWV) может быть проблематичным в тепличном и полевом производстве. Для аллеля устойчивости к TSWV, Tsw, на хромосоме 10 у C. chinense были разработаны маркеры с расщепленной амплифицированной полиморфной последовательностью (CAPS) (Moury et al., 2000). Широкое использование Tsw привело к появлению и распространению вирулентных штаммов TSWV в ряде производственных регионов.
Новые приложения геномики расширяют возможности для выявления локусов устойчивости к болезни. Используя платформу EcoTILLING, Ибиза и др. (2010) выявили высокий уровень полиморфизма в факторах инициации трансляции eIF4E, eIF(iso)4E, eIF4G и eIF(iso)4G, которые нарушают цикл нескольких РНК-вирусов, заражающих Capsicum. Эти мутации представляют собой потенциальные локусы устойчивости к вирусам для создания зародышевой плазмы, устойчивой к вирулентным штаммам патогенов.
Насекомые, клещи и устойчивость к нематоде
Тля, трипсы и паутинные клещи являются основными членистоногими вредителями перца в тепличном и полевом производстве. Белокрылка может встречаться в теплице, но ее можно адекватно контролировать с помощью хищных насекомых или пестицидов. Зеленая персиковая тля может переносить более 50 вирусных заболеваний, таких как вирус огуречной мозаики и вирус табачного увядания. Арати и др. (2008) выявили наследственную изменчивость плотности и длины трихомов у C. annuum, которая была связана с уменьшением численности трипсов и клещей. Усилия по выведению новых сортов, устойчивых к насекомым и клещам, не увенчались успехом из-за отсутствия зародышевой плазмы с высоким уровнем наследственной устойчивости. За исключением нематод, пестициды были основным средством борьбы с вредителями.
Снижение доступности почвенных фумигантов приводит к необходимости использования устойчивых к нематодам сортов там, где происходит заражение почвы (Fery and Thies, 1998; Djian-Caporalino et al., 2001). Четыре экономически важных вида корневых нематод — Meloidogyne incognita, M. arenia, M. javanica и M. hapla — вызывают галлизацию корней перца и снижение жизнеспособности растений. Описано множество генов устойчивости к нематодам. Некоторые из этих генов видоспецифичны или эффективны против ряда видов нематод. Доминантный ген N был описан Харе (1956). Ген N придает устойчивость к A4. incognita, M. arenaria расы 1 и 2 и AT. javanica у C. annuum, но не обуславливает устойчивость к M. hapla (Thies and Fery, 2000). Были определены позиции на карте для доминантных генов Me3 и Me4, которые обеспечивают термостабильную устойчивость к корневой узловой нематоде у перца (Djian- Caporalino et al., 2001). Два доминантных гена, Mech-1 и Mech-2, передают устойчивость к AT. chitwoodi (Djian-Caporalino et al., 2004). Многие гены устойчивости к нематодам были картированы на хромосоме P9 в геномной области, которая ортологична хромосоме T12 томата и хромосоме XII картофеля (Djian- Caporalino et al., 2007b).
Абиотические стрессы
Перец чувствителен к абиотическим стрессам, включая засуху, затопление, засоление и экстремальные температуры. Селекция на устойчивость к абиотическим стрессам у перца является трудной задачей в свете сложного наследования устойчивости и трудностей поддержания надежных условий отбора. Capsicum демонстрирует широкую адаптивность к различным условиям окружающей среды, о чем свидетельствует географическое распространение рода в его естественном ареале. Трудность селекции на устойчивость к абиотическим стрессам иллюстрируется появлением семян при низкой температуре, когда оценки наследственности и генетического усиления были низкими у C. baccatum var. pendulum (Randle and Honma, 1980). Несмотря на прогнозируемую медленную реакцию отбора на температурный стресс у перца, прогресс, достигнутый в родственных пасленовых культурах, таких как томат (Scott et al., 1998; Foolad, 2007) для улучшения устойчивости к жаре и соли в культивируемой зародышевой плазме, предполагает, что сопоставимый прогресс может быть достигнут в перце. На молекулярном уровне прогресс в выяснении механизмов стрессоустойчивости, таких как устойчивость к солевому стрессу (Lee, S.C. et al., 2010) и засухоустойчивость (Kim, E. et al., 2010; Chung et al., 2003), открывает новые возможности для селекции на устойчивость к абиотическим стрессам у перца.
Селекция на качественные признаки
В зародышевой плазме Capsicum существует значительное разнообразие формы, размера и цвета плодов и листьев, а также габитуса растений. У Capsicum было идентифицировано более 290 генов для уникальных садоводческих характеристик (Lippert et al., 1965, 1966; Daskalov and Poulos, 1994; Wang and Bosland, 2006). По сравнению с томатом, пасленовым родственником перца, мы знаем значительно меньше о генетической основе вариаций признаков, связанных с плодами и растениями перца. Классические генетические исследования определили наследование многочисленных генов, влияющих на эти признаки. Наличие локусов количественных признаков у томата, влияющих на такие признаки, как форма и размер плода (Bemacchi et al., 1998), облегчит идентификацию подобных локусов у перца. Аналогично, приписывание функций фенотипическим локусам у перца быстро продвигается вперед благодаря работе с родственными видами. Thorup et al. (2000), например, продемонстрировали, что метод генов-кандидатов может быть использован для установления связи между специфическими метаболическими фенотипами томата, связанными с каротиноидами, и локусами, влияющими на эти фенотипы у перца.
Цвет
Цвет плодов перца является важным фактором, определяющим качество свежей и переработанной продукции. Цвет недозрелых плодов перца варьируется от сиреневого до темно-фиолетового и почти черного, через различные оттенки зеленого и желтого до цвета слоновой кости. Цвет спелых плодов перца варьируется в градациях от желтого до оранжевого и красного, включая коричневый, который возникает из-за сохранения хлорофилла в зрелых плодах с красным пигментом (Smith, 1950). Цвет листьев и стеблей варьируется от зеленого до различных оттенков зелено-фиолетового и почти черного. Цвет цветка варьируется от белого, зеленовато-белого до пурпурного. Пигментация пыльников варьируется от голубого до фиолетового и желтого. Цвет цветка и цвет пыльников иногда являются полезными таксономическими критериями для различения различных видов Capsicum.
Хлорофиллы и каротиноиды
Цвет зрелых плодов является результатом уменьшения пигментации хлорофилла и антоцианов и накопления каротиноидных пигментов. Существует ряд генов, которые влияют на накопление более 30 различных каротиноидов в зрелых плодах (Matus et al., 1991). Капсантин и капсорубин являются основными пигментами в красных плодах; в то время как виола-ксантин и р-каротин являются основными пигментами в оранжевых плодах (Gross, 1991). Ранние исследования показали, что накопление р-каротина контролируется локусом B (β-каротин) и вторым модифицирующим локусом T (высокий β-каротин) (Brauer, 1962). Накопление капсантина и капсорубина контролируется локусом Y (желтый цвет зрелых плодов) и двумя модифицирующими локусами C1 (ингибиторы каротиноидных пигментов) и C2 (Boswell, 1937; Smith, 1950). Локусу Y была присвоена функция (капсантин-капсорубин синтаза), и он был картирован на хромосоме 6 (Popovsky and Paran, 2000). Один доминантный ген, соответствующий локусу Y, был определен как ген капсантин-капсорубин-синтазы (Ccs), делеция которого приводит к желтой окраске зрелых плодов (Lefebvre et al., 1998). Недавно выявление двух точечных мутаций в Ccs и отсутствие транскрипта Ccs в желтых плодах позволило предположить, что глушение транскрипционного гена, не опосредованное смыслом, а не делеция структурного гена также может объяснять желтую окраску зрелых плодов (Ha et al., 2007). Локусу C2 также была присвоена функция (фитоен-синтаза), и он был картирован на хромосоме 4 (Huh et al., 2001). Kim, O. et al. (2010) определили, что сплайс-мутация приводит к нарушению активности c2, вызывая оранжевую окраску плодов. Было показано, что оранжевая окраска плодов является результатом отсутствия Ccs (Popovsky and Paran, 2000; Lang et al., 2004). Поповский и Паран (2000) показали, что оранжевый цвет может возникать в результате двух возможных генотипов, доминантных или рецессивных по Ccs. Гузман и др. (2010) приводят доказательства того, что оранжевый цвет плодов перца может быть обусловлен либо накоплением p-каротина, либо, в двух случаях, накоплением только красного и желтого каротиноидов. Аллельная изменчивость четырех генов биосинтеза каротиноидов, Psy, Lcyb, CrtZ-2 и Ccs, кодирующих функциональные ферменты фитоен-синтазы, ликопин β-циклазы и β-каротин гидроксилазы в оранжево окрашенных плодах, позволяет предположить, что регуляторные элементы экспрессии генов, а не структурные последовательности кодирования генов, могут объяснять новый фенотип оранжевых плодов.
Также был описан новый рецессивный ген be, который вызывает высокое содержание β-каротина в плодах, блокируя гидроксилирование β-каротина до β-криптоксантина (Chalukova et al., 1993; Daskalov et al., 1995). В зрелых плодах ген фиксатора хлорофилла (cl) объединяется с генами y+ (красный цвет плодов) или y (желтый цвет плодов), что приводит к коричневому или оливково-зеленому цвету зрелых плодов, соответственно (Smith, 1948, 1950). Локус cl картируется на длинное плечо хромосомы 1 перца, область генома перца, которая ортологична длинному плечу хромосомы 8 томата, где расположен локус зеленой мякоти (gf) (Tanksley et al., 1992; Efrati el al., 2005). Оба локуса кодируют гомологи белка STAY-GREEN риса, что позволяет предположить, что эти локусы ортологичны (Barry et al., 2008; Borovsky and Paran, 2008). Полученные данные позволяют предположить, что cl и gf являются ортологичными локусами.
Антоцианы
Пигментация плодов перца от фиолетового до черного цвета является результатом накопления антоцианов. Подобные градации пурпурной пигментации можно наблюдать и в других частях растения Capsicum. Улучшение сортов с пурпурной или почти черной окраской листьев вызвало новый интерес в селекции новых декоративных сортов перца (Stommel and Griesbach, 2005, 2008a, b). В плодах перца антоцианин обычно преходящ и уменьшается во время созревания плодов. Напротив, пурпурная пигментация обычно стабильна в течение развития растения в других органах генотипов, которые демонстрируют накопление антоциана. Антоциановый пигмент, обнаруженный в листьях, цветках и незрелых плодах C. annuum, — это дельфинидин-3-п-кумароилрутинозид-5-глюкозид (Lightbourn et al., 2008).
На накопление антоцианов у C. annuum влияет неполностью доминантный ген A и второй модифицирующий ген MoA (Deshpande, 1933; Peterson, 1959). Локус A сцеплен в C. annum с sw (серно-белый цвет незрелых плодов) и O (округлая форма плодов). В соответствии с этими сообщениями, мы ранее показали, что накопление антоцианов в незрелых плодах C. annuum просто наследуется с модифицирующим действием генов (Stommel and Griesbach, 2008c).
Уровни транскриптов генов биосинтеза антоциана значительно выше в антоцианин-пигментированных тканях, чем в непигментированных (Borovsky et al., 2004; Stommel et al., 2009). Транскрипция структурных генов антоциана требует экспрессии по крайней мере одного члена каждого из трех семейств транскрипционных факторов: MYC, MYB и WD40. Эти транскрипционные факторы образуют комплекс, который связывается с промоторами структурных генов, тем самым модулируя экспрессию генов. Локус A перца кодирует фактор транскрипции Myb (MybA), который отсутствует в генотипах, не накапливающих антоцианин (Borovsky et al., 2004). Stommel et al. (2009) продемонстрировали, что дифференциальная экспрессия MybA, а также Myc в C. annuum происходит одновременно с накоплением антоциана в тканях цветков и плодов C. annuum. В отличие от ситуации в цветках и плодах, дифференциальная экспрессия MybA и Myc не наблюдалась в листовой ткани, что позволяет предположить, что в регуляцию биосинтеза антоцианов в разных частях растения C. annuum вносят вклад различные механизмы. В то время как цвет цветков и плодов на основе антоцианов можно разделить на дискретные классы, в селекционных популяциях, сегрегирующих по пигментации листьев, наблюдается непрерывный диапазон цветовых оценок (Stommel and Griesbach, 2008c). Высокая наследственность в широком и узком смысле для пигментации антоциана листьев подтверждает исследования экспрессии генов, указывающие на то, что наследование антоциана листьев является более сложным и не ограничивается действием A и MoA. Аддитивное действие генов и эпистаз вносят свой вклад в пигментацию антоциана листьев. В соответствии с вкладом аддитивных эффектов, развитие идеотипов перца с истинно черной листвой потребовало повторяющегося отбора на интенсивность пигментации листвы (Stommel and Griesbach, 2005, 2008a, b).
Дополнительные гены, связанные с антоцианом, включают ген без антоциана (al-1 — al-5), который предотвращает пурпурную окраску, что приводит к зеленым узлам и желтым пыльникам, и является эпистатическим и неаллельным к A, As (антоцианин стика; пурпурный в отсутствие A или Asf) и Asf (антоцианин стика и нитей; пурпурный в отсутствие A) (Lippert et al., 1965, 1966). Дополнительные локусы без антоцианов, al6 и al7 из C. chinense и al8 из C. chacoense, действуют аналогично локусам без антоцианов, описанным у C. annuum (Csillery, 1983).
Капсаициноиды
Остроту перцу придают капсаициноиды — группа родственных алкалоидных соединений, характерных только для этого рода. Капсаициноиды образуются в результате конденсации ванилиламина со среднецепочечной разветвленной жирной кислотой (Bennett and Kirby, 1968; Suzuki et al., 1981; Sukrasno and Yeoman, 1993; Curry et al., 1999). Именно изменение ацильной группы определяет количество и качество ощущения жжения при употреблении (Todd et al., 1977; Krajewska and Powers, 1988).
Путь биосинтеза капсаициноидов достаточно хорошо охарактеризован с помощью ферментативных анализов и исследований генов-кандидатов или экспрессии генов (Bennett and Kirby, 1968; Curry et al., 1999; del Rosario Abraham-Juarez et al., 2008; Mazourek et al., 2009). Несколько ферментов были клонированы (Curry et al., 1999; Aluru et al., 2003; Stewart etal., 2005; Mazourek et al., 2009). Подробности биосинтетического пути можно посмотреть в базе данных метаболических путей SolCyc (www.sgn.cornell.edu/ tools/solcyc). Генетическое картирование связей генов пути показало рассеивание локусов по группам связей и связь между несколькими локусами пути (Mazourek et al., 2009). Кроме того, личность конечного фермента, капсаициноидной синтазы, катализирующей конденсацию ароматических и кислотных молекул, остается неустановленной (Blum et al., 2003; Stewart et al., 2007; Mazourek et al., 2009). Знания о регуляторных компонентах по-прежнему скудны.
Наличие жгучести у Capsicum наследуется через единственный доминантный ген Punl (бывший локус C) (Webber, 1912; Deshpande, 1935; Greenleaf, 1952). Punl был картирован на хромосоме 2 в межвидовой популяции F2, полученной от скрещивания жгучего C. frutescens и нежгучего C. annuum болгарского перца (Blum et al., 2002). Нежгучий перец, который часто называют «сладким перцем», неоднократно возникал у нескольких видов Capsicum из жгучих сортов благодаря рецессивным аллелям с потерей функции в локусе Punl (Blum et al., 2002; Stewart et al., 2007; Stellari et al., 2010). Стюарт и др. (2005) идентифицировали предполагаемую ацилтрансферазу (AT3), кодируемую локусом Punl. Рецессивный punl, характеризующийся делецией в 2,5 кб, охватывающей промоторную область и первый экзон, широко распространен в одомашненных непунцовых посевах. Другой рецессивный аллель, punl2, был идентифицирован у C. chinense, где мутация со сдвигом рамки в первом экзоне приводит к усеченному белку. Мутация связана с невосприимчивостью и пониженной регуляцией нескольких генов пути. Третий рецессивный вариант, punl3, характеризующийся инделем во втором экзоне, был обнаружен у C. frutescens. Рецессивный аллель punl с потерей жгучести, обнаруженный у C. chacoense, не является аллельным по отношению к вышеуказанным мутациям, но эпистатически взаимодействует с ними. Филогенетический анализ позволяет предположить, что аллели с потерей функции возникли у общего предка видов (Ben Chaim et al., 2006; Stewart et al., 2007; Stellari et al., 2010).
Кроме Punl, были идентифицированы два гена Catf-1 и Catf-2, кодирующие ацилтрансферазы. Catf-1 показывает точную гомологию последовательности с Punl, а Catf-2 — на 3 конце. AT3 и Catf-2 расположены на разных геномных участках (Lang et al., 2006; Garces-Claver et al., 2007). Punl, Catf-1 и, кроме того, Csyl, ген, клонированный Prasad et al. (2006), были предположены в качестве кандидатов на ген капсаицин-синтазы, конечного фермента в пути, объединяющем фенилпропаноидный путь и путь жирных кислот с разветвленной цепью. К сожалению, идентичность со специфическим для перца конденсирующим белком ни для одного из этих генов не была подтверждена (Garces-Claver et al., 2007; Prasad et al., 2008).
Разнообразие в степени жгучести велико среди видов жгучего перца (Bosland, 1996). Наследственность содержания капсаициноидов количественная, подвержена влиянию окружающей среды и может отражать контроль со стороны регуляторных факторов (Harvell and Bosland, 1997; Curry et al., 1999; Zewdie and Bosland, 2000; Blum et al., 2003; Paran et al., 2010). Регуляция зависит как от ткани, так и от развития. За последние десятилетия были разработаны различные маркеры, связанные с локусами жгучести. Однако большинство маркеров не нашли практического применения из-за потери ассоциации с признаком в результате расстояния сцепления и/или расхождения последовательностей в зародышевой плазме перца (Blum et al., 2002; Lee et al., 2005; Minamiyama et al., 2005).
Основной QTL для содержания капсаициноидов, cap, был идентифицирован на хромосоме 7 в сегрегационной популяции, полученной от скрещивания жгучего (C. frutescens BG2816) и нежгучего родителя (C. anuum cv. Maor) (Blum et al., 2003). Было показано, что Cap7.1 увеличивает транскрипцию Punl. Этот локус не совпадает ни с одним из известных локусов, кодирующих ферменты в капсаициноидном пути, и поэтому может иметь регуляторную природу (Paran et al., 2010). Два дополнительных QTL, названные cap7.2 и cap8.1, были специфичны для анализируемых генетических фонов. В популяции, полученной от родителей с высоким и низким уровнем жгучести, дигенетическое взаимодействие локусов на хромосомах 2 и 7 обусловило самый сильный эффект на жгучесть (Ben Chaim et al., 2006). Минорный QTL на хромосоме 7, как полагают, является ортологичным для cap.
Еще две группы продуктов, получаемых в результате биосинтеза капсаициноидов, — это аналоги капсаициноидов, капси-ноиды и капсикониноиды. Оба они вызывают очень слабую индукцию теплового ощущения или вообще не вызывают его при употреблении. Капсиноиды были впервые обнаружены в спонтанном мутанте C. annuum с потерей жгучести, названном впоследствии «CH- 19 Sweet» (Yazawa et al., 1989; Kobata et al., 1998). Причинная мутация была идентифицирована как преждевременный стоп-кодон в предполагаемом гене аминотрансферазы (pAMT) перед капсаицин-синтазой в биосинтетическом пути (Lang et al., 2009). Позже среди зародышевой плазмы был выявлен второй аллель потери функции, характеризующийся однонуклеотидной заменой (Tanaka et al., 2009).
Морфология
У видов Capsicum существует разнообразие в росте растений, форме, размере и ориентации плодов. Эта вариативность дает уникальные возможности для выведения идеотипов, наиболее подходящих для кулинарных и новых декоративных целей (Stommel and Bosland, 2006).
Растение
Было описано несколько генов, влияющих на рост растений. Доминантный ген Dt+ и рецессивный ген ct+ обуславливают неопределенный тип роста. В гомозиготном доминантном или гетерозиготном состоянии ct+ эпистатичен к dt, тогда как dt эпистатичен к ct (McCammon and Honma, 1984). Доминантный супрессор Su подавляет эпистатическое действие ct+. Экспрессия рецессивного гена fasciculate, fa, приводит к компактному, кустистому растению с короткими междоузлиями и более концентрированным плодоношением (Lippert et al., 1965). Доминантная форма гена ct вызывает укорочение междоузлий, снижая высоту растения до половины от нормальной. Рецессивный ген brl вызывает укороченные междоузлия стебля, а также укороченные черешки листьев. Гены карликового роста растений, dwl и dw2, значительно уменьшают размер растений, вызывают укороченные междоузлия и утолщенные темно-зеленые листья.
Описано множество генов, влияющих на морфологию листьев. Потенциально полезные мутантные гены для декоративного применения включают ген frilly, fr, экспрессия которого характеризуется волнистыми краями листьев. Ген anv вызывает образование длинных и узких листьев, в то время как локус rl вызывает округление листьев, уменьшая их длину, но не ширину. Наличие гомозиготной рецессивной формы ругозы, ru, вызывает ругозную или савойскую форму зрелых листьев, которые темно-зеленые, чем нормальные, без снижения жизнеспособности растений.
Плод
Один локус, O (Oblate), был выделен для контроля круглой формы плода (Kaiser, 1935; Khambanonda, 1950; Peterson, 1959). В то время как Петерсон (1959) обнаружил, что O полностью доминирует для круглых плодов, Хамбанонда (1950) обнаружил, что O лишь частично доминирует, а примерно 30 второстепенных генов изменяют круглую или удлиненную форму плода. Липперт и др. (1965) описали ген для заостренной верхушки плода (Pt), который не был полностью доминантным по отношению к тупому. Были описаны два основных QTL для формы плода (fs3.1, fsl0.1) (Ben Chaim et al., 2003a, b). В скрещиваниях между кругло- и удлиненноплодными растениями Штоммель и Грисбах (2008c) наблюдали непрерывный диапазон форм и размеров плодов, что свидетельствует о количественном наследовании, причем гены для мелких плодов в целом доминируют над генами для крупного размера плодов. Сообщалось о незначительных QTLs для размера плодов (Ben Chaim et al., 2001b; Rao et al., 2003; Barchi et al., 2009). Наибольший процент фенотипической изменчивости объяснялся при обнаружении многочисленных QTL с незначительными эффектами. Крупноплодные перцы, выведенные для кулинарного использования, обычно имеют длинную плодоножку, чтобы обеспечить расширение развивающегося плода. Длина плодоножки контролируется несколькими генами, причем длинные плодоножки частично доминируют над короткими (Subramanya and Ozaki, 1980). Два локуса, up-1 и up-2, обуславливают вертикальную ориентацию цветоножки и плода (Lippert et al., 1965; Gopalakrishnan et al., 1989; Lee, H.R. et al., 2008).
Для Capsicum annuum характерно образование одиночного цветка на узле ветви. Напротив, C. chinense обычно производит от двух до четырех цветков на узел, обеспечивая потенциал для множественного плодоношения на узле (Lippert et al., 1966). Локус фасцикуляции (fa) влияет на группировку плодов, а также на длину междоузлий (Lippert et al., 1965, 1966). Субраманья (1983) определил, что три основных гена контролируют множество цветков и что для получения дополнительных цветков на узел требуется больше генов. Работая с другим скрещиванием C. annuum x C. chinense, Танксли и Иглесиас-Оливас (1984) сообщили, что минимум пять независимо сегрегирующих хромосомных областей контролируют различия в поведении при цветении и что эпистатические взаимодействия между независимыми хромосомными областями играют главную роль в определении количества цветков на узел. При другом скрещивании C. annuum x C. chinense Шух и Фонтенот (1990) подсчитали, что три гена плюс эпистаз контролируют количество цветков на узел. Штоммель и Грисбах (2008c) определили, что один главный ген обуславливает наличие одного или нескольких цветков на узел и что количество цветков на кластер наследуется количественно. Поскольку габитус роста растений с кластеризованными плодами не был нарушен, кластеризация, скорее всего, не является результатом экспрессии fa. Кластеризация плодов была также связана с красным цветом плодов.
Генная инженерия
Генетическая инженерия перца зависит от надежного способа трансформации и регенерации в культуре тканей. Предварительные исследования по генетической трансформации Capsicum привели к получению нескольких трансформированных саженцев сладкого и острого перца. Исследования Zhu et al. (1996) позволили получить устойчивость к вирусу огуречной мозаики у проростков чили путем интеграции генов, отвечающих за различные белковые компоненты самого вируса, в геном целевого растения. Ли и др. (2003) описали систему трансформации перца, утверждая, что им удалось преодолеть препятствия на пути трансформации, сначала разработав эффективный метод регенерации котиледонных эксплантов in vitro. Впоследствии Ли и др. (2008) разработали систему трансформации с использованием Agrobacterium, который был трансфицирован геном, кодирующим белок оболочки вируса огуречной мозаики; генетически модифицированные растения были устойчивы к новому патотипу вируса огуречной мозаики, вызывающему потери урожая в Корее.
Культура тканей
Культура тканей является ключевым инструментом биотехнологии растений, использующим тотипотентную природу растительных клеток. Эта концепция была предложена Хаберландтом (1902) и означает, что растительные клетки имеют необходимые генетические и физиологические механизмы для регенерации целых растений в асептических условиях. Морфогенез позволяет регенерировать растения из клеток, тканей и культуры органов и является фундаментальным процессом в применении биотехнологии растений для размножения и генетического улучшения. Регенерация растений перца ограничена из-за неподатливости эксплантов к манипуляциям in vitro (Franck-Duchenne et al., 1998; Steinitz et al., 1999; Ochoa-Alejo and Ramirez-Malagon, 2001). Потребность в жизнеспособных протоколах регенерации для применения в улучшении и трансформации растений необходима для понимания природы рекальцитранса у Capsicum.
Культуру тканей перца можно разделить на различные области исследований:
- культура пыльников и микроспор;
- регенерация протопластов;
- восстановление эмбрионов;
- органогенез.
Создание новой формы и организации там, где ранее отсутствовала, называется морфогенезом. Ткани или органы, обладающие способностью к морфогенезу, называют морфогенными (морфогенетическими). Органогенез и соматический эмбриогенез могут быть использованы для достижения регенерации растений и могут происходить прямо и косвенно из эксплантов. Формирование монополярных структур, побегов и/или корней, которые сохраняют сосудистую связь с тканью, из которой они произошли, является органогенезом. Соматический эмбриогенез — это процесс, в результате которого возникают биполярные структуры, с четко определенным и хорошо различимым каулинарным и радикальным апексом, без сосудистой связи с тканью, из которой они произошли.
Культура пыльцы и микроспор
Культура пыльников включает в себя регенерацию гаплоидных проростков из ткани микроспор пыльцы. Используя колхицин, можно удвоить число хромосом, чтобы получить «двугаплоидные» растения, гомозиготные по всем локусам. Для получения подобных растений потребуется много поколений самоопыления. Растения, гомозиготные по всем локусам, бесценны для различных исследований.
Исследования культуры пыльников у перца начались в начале 1970-х годов, и на сегодняшний день это наиболее широко опробованная система культуры тканей Capsicum. Куо и др. (1973) сообщили, что пыльники красного перца можно культивировать на стандартных средах и ростовых веществах. Из пыльников образовались эмбриоиды и калли, и было получено несколько проростков. Цитологическое исследование кончиков корней показало, что некоторые из проростков на самом деле были гаплоидными по своей природе.
Год спустя Харн и др. (1974) сообщили, как они смогли вызвать каллус и эмбриоиды из пыльников ‘Kimjang Kochu’, корейского сорта острого перца. Пыльники культивировали на среде Мурашиге и Скоуга, тестировали различные регуляторы роста. Соматические каллусы были сформированы из соединительной, нитевидной и внутренней тканей пыльника. Гаплоидные каллусы и эмбриоиды образовывались из тканей микроспоры в локуле пыльника, особенно когда используемые пыльники находились на поздней неэнуклеативной стадии.
Исследователи из Франции сообщили, что им удалось получить от одного до трех проростков из каждых 100 культивируемых пыльников (Sibi et al., 1979). Используемый процесс был уникальным, поскольку он включал предварительную обработку бутонов холодом при 4 °C в течение 48 часов и перенос пыльников после 12 дней культуры на другую среду. При исследовании хромосомного числа 24 проростков было обнаружено, что 20 из них являются гаплоидными, два — диплоидными и два — триплоидными.
Усовершенствованный метод, позволяющий получить большее количество растений из культуры пыльников (от пяти до 40 растений на 100 культивированных пыльников), был описан Дюма де Вольксом и др. (1982). Факторы, которые считаются важными для повышения успеха, — это инкубация при 35 °C, в темноте, в течение первых дней культуры, и перенос культивированных пыльников через 12 дней на новую среду. Наблюдалась высокая частота гаплоидных и гаплоидных/диплоидных химер.
Однородность и генетическая стабильность двойных гаплоидных линий, полученных из культур пыльников Capsicum, были впоследствии изучены Nervo и др. (1995) с использованием морфологических и молекулярных маркеров. Это исследование показало, что двойные гаплоидные растения являются гомозиготными и генетически стабильными после самоопыления.
Ким и др. (2007) описали высокую частоту получения эмбрионов и регенерации растений с помощью культуры микроспор острого перца. Авторы особо отметили преимущества изолированной культуры микроспор (по сравнению с культурой пыльников) и описали условия оптимизации, которые позволили им эффективно регенерировать растения.
Регенерация протопластов
Протопласты — это растительные клетки без клеточных стенок на жидкой среде, выделенные из клеток тканей, отобранных и культивируемых в специальных условиях для получения новых особей in vitro. Полученные протопласты могут быть соединены друг с другом для образования цибрид, или они могут быть подвергнуты другим методам, в которых предполагается трансформация. Это может быть возможно для восстановления сомаклональных вариантов, уже существующих генетически измененных соматических клеток эксплантов тканей-доноров, или соматических гибридов в случаях половой межвидовой несовместимости и F1 гибридной стерильности. Это также может быть использовано как метод генетической трансформации или для поглощения чужеродного генома.
Саксена и др. (1981) выделили протопласты из клеток мезофилла культурного сорта «California Wonder», наблюдая митотическое деление и образование каллуса, за которым последовала дифференциация в целые цветущие растения. Диас и др. (1988) сообщили о выделении протопластов из четырех генотипов C. annuum и одного из C. chinense; целые растения одного сорта, ‘Dulca Italiano’, были успешно регенерированы.
Имеется мало исследований протопластов из Capsicum, как сообщают Ochoa- Alejo и Ramirez-Malagon (2001).
Культура эмбрионов
Культура эмбрионов полезна, когда требуется «спасение эмбрионов». Эмбрионы, полученные в результате межвидовой гибридизации, часто отмирают до завершения развития семян, но некоторые межвидовые гибридизации могут дать жизнеспособные растения, если эмбрион спасти на ранней стадии развития. Этот метод, включающий вырезание эмбрионов и помещение их на питательную среду, был реализован у Capsicum (Fari, 1995).
Органогенез
Органогенез — это сложный морфогенетический процесс, включающий формирование монополярной структуры для образования побегов или корней. Органогенез включает извлечение растительных тканей, таких как гипокотиль или котиледон из прорастающих семян, и помещение этих эксплантов на среду культуры тканей, чтобы вызвать дифференциацию и развитие органов и проростков.
Gunay и Rao (1978) первыми сообщили об успешной регенерации побегов и растений из котиледонов и гипокотильных эксплантов у Capsicum, используя C. annuum cvs Pimento и California Wonder и гибрид C. frutescens (‘Bharath’); побеговые почки и корни были регенерированы под воздействием определенных гормонов.
Несколько лет спустя Фари и Чако (1981) исследовали различные участки гипокотилей эксплантов C. annuum cv. T. Havani, чтобы определить их пригодность для органогенеза. Они определили, что различные сегменты по-разному реагируют на культуру: апикальные участки дают только побеговые почки, средние участки образуют корни, а базальные участки дают каллус.
Agrawal и Chandra (1983) сообщили о дифференциации многочисленных побеговых почек и проростков в культивируемых зародышах C. annuum cv. Mathania. Многочисленные побеговые почки были получены на краях расширенных котиледонов эмбрионов, выращенных на среде с BA. Аналогичные результаты были получены Sripichit и др. (1987), которые обнаружили, что BA более эффективен, чем кинетин (Kin), чтобы вызвать образование побегов на эксплантах котиледонов, выращенных на среде MS.
Филлипс и Хубстенбергер (1985) изучили параметры культуры, подходящие для органогенеза у сортов перца. Они пришли к выводу, что свет и температура являются важными факторами органогенеза побегов и корней, что для удлинения побегов и укоренения требуются низкие уровни определенных гормонов, а для образования придаточных почек необходимы высокие уровни одного гормона. Они также продемонстрировали, что в качестве источника углерода глюкоза предпочтительнее сахарозы.
Прямая и непрямая регенерация растений in vitro из перца чили, cv. Soroksari, было сообщено Берляком (1999). Прямая регенерация побегов была достигнута только из базальных частей эксплантов верхушек побегов, выращенных на среде с BA или зеалоном, а также с BA и IAA. Редди и др. (2002) изучали влияние триаконтанола (TRIA) на размножение побегов и укоренение полученных in vitro верхушек побегов C.frutescens и Decalepis hamiltonii. Kumar et al. (2005) получили in vitro прямое множественное образование побегов из эксплантов проростков индийского сильно жгучего C. annuum сортов Arka Abhir и Arka Lohit. Santana- Buzzy et al. (2005) индуцировали множественные побеги из перца хабанеро. Экспланты культивировали в среде MS, дополненной различными концентрациями кинетина, BA и тидиазурона (TDZ), причем последний был ключевым регулятором роста в этом процессе. Величка и др. (2006) изучали каллугенезис и способность к регенерации котиледонов и гипокотилей проростков перца (Santana-Buzzy et al., 2006). Хан и др. (2006) индуцировали множественные побеги путем культивирования узловых эксплантов, вырезанных из 1-месячных асептических проростков C. annuum, cv. Pusa Jwala, на среде MS, дополненной TDZ. Peddaboina et al. (2006) разработали процедуру для размножения in vitro C. annuum, cv. CA960, C. baccatum, C. frutescens и C. praetermissum с использованием эксплантов меристемы побега, а также с использованием измененной среды для быстрого роста и биопроб со средой культуры ткани табака. Montalvo-Peniche et al. (2007) изучали влияние нитрата, сахарозы и осмотических регуляторов (маннита и сорбита) на рост зародышей перца хабанеро для сохранения in vitro.
Маннитол 2% имел лучший эффект на минимальный рост проростков и не влиял на физиологию и качество растений. Sanatombi и Sharma (2008) сообщили о регенерации in vitro из эксплантов листьев, котиледонов и гипокотилей сортов Capsicum путем прямого органогенеза. Valadez- Bustos et al. (2009) разработали протокол для регенерации in vitro халапеньо и серрано, C. annuumvar.glabriusculum/aviculare (Piquin), и хабанеро путем прямого органогенеза. Ashrafuzzaman et al. (2009) разработали эффективный протокол размножения in vitro для клонального размножения сортов чили, используя котиледон, гипокотиль и верхушки побегов от растений, регенерированных in vitro. Удлинение побегов было ускорено с помощью добавок GA3 и AgNO3. Bello-Bello et al. (2010) оценили эффективность узловых сегментов перца хабанеро во время индукции и удлинения побегов, используя различные полутвердые и жидкие культуры. Для размножения и удлинения изолированных побегов использовался биореактор временного погружения (BioMINT™). Авторы сообщили об эффективном протоколе для размножения перца хабанеро in vitro, который позволяет получить растения с высокой выживаемостью при пересадке в почву.
Рекальцитранс рода Capsicum
Рекальцитранс может возникать на всех этапах культурного режима, и мало что известно о его причинных факторах. Capsicum — универсальное растение, но у него нет высокоэффективной воспроизводимой системы регенерации растений. Другие представители семейства Solanaceae, например, картофель, томат, табак и петуния, часто используются в качестве модельных систем в культуре тканей. Несмотря на это, были проведены исследования по созданию системы регенерации для Capsicum. Fari (1986), Morrison et al. (1986), Ezura (1997), Ochoa-Alejo and Ramirez-Malagon (2001) и Kothari et al. (2010) опубликовали обзоры в этой области.
В Capsicum различия в органогенной способности были отмечены у различных генотипов перца (Christopher and Rajam, 1996), сортов (Ezura et al., 1993; Szasz et al., 1995; Ramirez-Malagon and Ochoa-Alejo, 1996) и видов (Christopher and Rajam, 1996) с использованием различных источников эксплантов (Ochoa-Alejo and Ireta-Moreno, 1990; Ezura et al., 1993; Szasz et al., 1995; Ramirez-Malagon and Ochoa-Alejo, 1996) и культуральных сред (Ochoa-Alejo and Ireta-Moreno, 1990; Ezura et al., 1993; Szasz et al., 1995; Ramirez-Malagon and Ochoa- Alejo, 1996; Venkataiah et al., 2003; Sanatombi and Sharma, 2008). Большинство отчетов сходятся во мнении о низкой эффективности и воспроизводимости большинства систем регенерации.
Рекальцитранс — сложное явление, включающее физиологию всего растения-донора, манипуляции in vitro с регенерационной способностью клеток и тканей растения, а также другие факторы, относящиеся к физиологии стресса in vitro (Benson, 2000). Сантана-Буззи и др. (2005) наблюдали, что при выращивании эксплантов перца хабанеро (C. chinense Jacq.) в закрытых контейнерах без вентиляции и без регуляторов роста образование каллуса происходило на верхней стороне листьев и вдоль стеблей. Растения имели этиолированные стебли, хлороз листьев и раннее сбрасывание листьев, а проростки цвели внутри сосудов культуры. Всходы и растения, выращенные в вентилируемых контейнерах, показали нормальное развитие.
Santana-Buzzy et al. (2006) оценили влияние нитрата серебра и хлорида кобальта на выработку этилена во время развития in vitro проростков перца хабанеро. Хлорид кобальта частично ингибировал выработку этилена во время культуры in vitro. Нитрат серебра не ингибировал выработку этилена, но подавлял действие этого гормона на проростки. Для лучшего понимания роли этилена в процессе роста и развития и его взаимосвязи с рекальцификацией у Capsicum необходимы дальнейшие исследования. Дифференциальная экспрессия генов была изучена в побегах C. chinense, выращенных в невентилируемых и вентилируемых сосудах (Santana-Buzzy, неопубликованное). Bello-Bello et al. (2010) сообщили о получении эффективного протокола прямого органогенеза у C. chinense. Однако удлинение побегов было возможно только в условиях временного погружения в биореактор типа BioMint (Robert et al., 2006).
В нескольких отчетах, большинство из которых посвящено C. annuum (Agrawal et al., 1989; Ochoa-Alejo and Ireta-Moreno, 1990; Valera-Montero and Ochoa-Alejo, 1992; Ramirez-Malagon and Ochoa-Alejo, 1996; Husain et al., 1999; Venkataiah et al., 2003; Santana-Buzzy et al., 2006; Bello-Bello et al., 2010), сообщается об относительном успехе морфогенеза побегов у Capsicum. Ограничивающим фактором для регенерации Capsicum в культурах является образование плохо выраженных листовых побегов, которые не удлиняются или сопротивляются удлинению, что ограничивает скорость развития побегов. Рекальцитранс Capsicum наблюдается в соматическом эмбриогенезе. Протоколы приводят к низкой эффективности и низкой воспроизводимости, высокой частоте деформированных эмбрионов и слабой способности эмбрионов развиваться в растения (Harini and Lakshmi Sita, 1993; Buyukalaca and Mavituna, 1996; Kintzios et al., 1998; Lopez-Puc et al., 2006; Zapata-Castillo et al., 2007). Регенерация C. chinense in vitro происходила путем органогенеза (Santana-Buzzy et al., 2005, 2006; Montalvo-Peniche et al., 2007; Bello-Bello et al., 2010), а также путем прямого и непрямого соматического эмбриогенеза (Lopez-Puc et al., 2006; Zapata-Castillo et al., 2007; Santana-Buzzy et al., 2009). Была разработана система прямого соматического эмбриогенеза в высокоэффективной жидкой среде для C. chinense (Santana-Buzzy, неопубликованное). Анализ с помощью SDS-PAGE и 2-D электрофореза показал, что содержание эндогенного белка уменьшалось в соматических эмбрионах C. chinense по мере развития. Сантана-Буззи (неопубликованное) определил, что некоторые белки с низкой молекулярной массой, присутствующие в протеиновом профиле зиготических эмбрионов вида, отсутствовали в профиле полос соматических эмбрионов. Также было определено эндогенное содержание полиаминов во время соматического эмбриогенеза. Кроме того, кадаверин присутствовал на уровне выше спермина и спермидина, а с помощью маркеров RAPD и ISSR была обнаружена высокая частота сомаклональных вариантов в регенерантах, полученных в результате соматического эмбриогенеза и органогенеза. В попытках регенерировать чили in vitro использовался ряд подходов.
Генотип и эксплант в регенерации
Генотип и тип экспланта являются важными факторами, ограничивающими регенерацию растений Capsicum in vitro. Существование сильной специфичности генотипа и экспланта в способности к регенерации различных видов рода и сортов одного вида является ограничивающим фактором для разработки стандартных протоколов регенерации Capsicum. Гунай и Рао (1978) сообщили об успешной регенерации растений перца из двух сортов Capsicum и гибрида C. frutescens («Baratha»), используя экспланты из котиледонов и гипокотилей, причем котиледоны оказались наиболее отзывчивыми. Аналогичные результаты были получены при использовании эксплантов зародышей C. annuum (Sripichit et al., 1987; Agrawal et al., 1989; Ebida and Hu, 1993; Binzel et al., 1996b), а также C. praetermissum, C. baccatum (Christopher and Rajam, 1996), C. frutescens и C. chinense (Kumar et al., 2007; Sanatombi and Sharma, 2008). Котиледоны, гипокотиль, листья, верхушки побегов, зиготические зародыши, эмбриональные листья, стебли, междоузлия и зрелые семена были использованы в качестве эксплантов для регенерации in vitro растений чили (Agrawal and Chandra, 1983; Agrawal et al., 1989; Alibert, 1990; Ebida and Hu, 1993; Ezura et al., 1993; Ramirez-Malagon and Ochoa-Alejo, 1996; Berljak, 1999; Santana- Buzzy et al., 2005; Lopez-Puc et al., 2006; Bello-Bello et al., 2010).
Кристофер и Раджам (1996) сообщили, что из листовых эксплантов постоянно образуется больше побегов, чем из гипокотилей или котиледонов (семядолей). Аналогичные результаты были получены Dabauza и Pena (2001) для эксплантов из котиледонов, листьев и верхушек побегов котиледонного узла, а также эмбриональных котиледонов, гипокотилей и из раненых проростков. Venkataiah et al. (2003) сообщили, что листовые экспланты превосходят котиледоны по морфогенезу побегов, а Santana-Buzzy et al. (2005) использовали различные по возрасту узловые и междоузлия асептических растений для оценки способности C. chinense к регенерации. Golegaonkar и Kantharajah (2006) исследовали способность к образованию побегов из эксплантов листьев и котиледонов и обнаружили, что частота регенерации зависит от экспланта, культуральной среды и сорта. Величка и др. (2006) изучали каллугенезис и способность к регенерации эксплантов котиледона и гипокотиля на базальной среде MS, дополненной BAP, IAA и GA3. Высокие уровни каллугенеза и органогенеза были получены в обоих типах эксплантов всех сортов. Наибольший процент растений-регенерантов был получен из котиледоновых эксплантов. Другими факторами, влияющими на органогенные реакции, являются положение экспланта в растении или физиологический возраст используемых проростков. Sanatombi и Sharma (2008) изучали влияние различных эксплантов у сортов C. annuum, C. frutescens и C. chinense и обнаружили, что листья и котиледоны наиболее отзывчивы по сравнению с гипокотилями. Ashrafuzzaman et al. (2009) оценивали экспланты гипокотилей, котиледонов и верхушек побегов C. annuum для определения потенциала регенерации и наблюдали большее образование каллуса и инициацию побегов в гипокотилях.
Эмбриогенный потенциал эксплантов Capsicum был гораздо более ограниченным. Большинство сообщений о соматическом эмбриогенезе ограничивается использованием незрелых или зрелых зиготических эмбрионов (Harini and Lakshmi Sita, 1993; Binzel et al., 1996a; Buyukalaca and Mavituna, 1996). Незрелые зиготические зародыши сделали возможной индукцию соматических зародышей у видов растений, которые считались неподатливыми (Ahloowalia, 1991; Raemakers et al., 1995; Arnold et al., 1996). Гипокотиль (Lopez-Puc et al., 2006; Zapata-Castillo et al., 2007) может быть использован для эффективной прямой и косвенной индукции соматических эмбрионов у C. chinense.
Соматический эмбриогенез
Соматический эмбриогенез (СЭ) — это путь развития, при котором соматические клетки развиваются в структуры, напоминающие зиготические эмбрионы (т.е. двуполые и без сосудистой связи с родительской тканью) через упорядоченную серию характерных эмбриологических стадий без слияния гамет. Соматические эмбрионы используются для изучения регуляции развития эмбрионов, а также в качестве инструмента для крупномасштабного вегетативного размножения. Изучение факторов, контролирующих морфогенез растений in vitro, желательно не только для разработки улучшенных систем регенерации, но и для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе эмбриогенеза растений. Соматический эмбриогенез у C. annmim был индуцирован в основном из незрелых зиготических эмбрионов (Harini and Lakshmi Sita, 1993; Binzel et al., 1996a; Jo et al., 1996) и зрелых зиготических эмбрионов (Buyukalaca and Mavituna, 1996). Кинтзиос и др. (2001) использовали экспланты листьев для соматического эмбриогенеза у Capsicum. Khan et al. (2006) и Lopez-Puc et al. (2006), работая с различными видами, сообщили о получении эмбрионов с использованием соматических почек, сегментов стебля и гипокотилей. Харини и Лакшми Сита (1993) разработали протокол регенерации in vitro из незрелых зиготических эмбрионов C. annmim путем прямого соматического эмбриогенеза. Buyukalaca и Mavituna (1996) сообщили о первом протоколе регенерации C. annmim cv. Ace путем соматического эмбриогенеза в жидкой среде с использованием зрелых эксплантов зиготических эмбрионов для формирования эмбриогенного каллуса. Эмбрионы созревали и превращались в растения in vivo и in vitro с эффективностью до 97%. Растения C. annmim были регенерированы из незрелых зиготических эмбрионов путем прямого соматического эмбриогенеза (Binzel et al., 1996a). Гистологическое исследование показало, что вторичный эмбриогенез происходит непосредственно из первичных соматических эмбрионов. Дифференциация эмбрионов происходила не синхронно, некоторые эмбрионы были набухшими и деформированными с фасцикуляциями. Более 70% зрелых нормальных соматических эмбрионов легко прорастали на среде MS, содержащей GA3 или TDZ, отдельно и в комбинации, и развивались в нормальные растения. Mavituna и Buyukalaca (1996) индуцировали соматический эмбриогенез перца в аэролифте и биореакторе с магнитным перемешиванием, сообщив, что потребность культур в кислороде может быть различной на каждой стадии эмбриогенеза. Кинтзиос и др. (2000), работая с молодыми листьями перца чили, наблюдали, что распространение шаровидных эмбрионов зависело от положения листьев на растении-доноре, а на индукцию соматических эмбрионов существенно влияло первоначальное инкубирование культуры при освещении или в темноте. Протокол для отделения соматических эмбрионов от эмбриогенных суспензионных культур был представлен (Buyukalaca et al., 2003).
Исследование, проведенное Steinitz et al. (2003), подтвердило усилия по уменьшению сохраняющихся недостатков в протоколах регенерации, о которых сообщалось для Capsicum. Эмбрионы, отделенные от эксплантов и пересаженные на среду без регуляторов роста, прорастали; восстановленные регенеранты были без побега, некоторые несли один деформированный котиледон, а другие не имели котиледонов. Регенеранты, лишенные побега, возникали независимо от типа ауксина и во всех генотипах, реагирующих на него. Отсутствие побега, вызванное неудачей в создании нормально функционирующей верхушечной меристемы побега, было основным нарушением развития, препятствующим регенерации нормальных растений путем прямого соматического эмбриогенеза. Поскольку стволовые клетки меристемы побега закладываются в эмбрионах глобулярной и сердцевидной стадии, они пришли к выводу, что отсутствие побега у прорастающих эмбрионов может быть следствием отклоняющейся дифференциации на ранних стадиях эмбриогенеза. Мы согласны с ними. Результаты других авторов показывают, что большинство деформаций соматических эмбрионов располагается в меристеме побега, и больше встречается на стадиях торпеды и котиледона (Lopez-Puc et al., 2006; Santana- Buzzy, неопубликованное). Однако Хан и др. (2006) сообщили об эффективном протоколе прямого соматического эмбриогенеза из сегментов стебля и верхушек побегов C. annuum. Все регенерированные растения были нормальными в отношении морфологии и характеристик роста. Lopez-Puc et al. (2006), работая с C. chinense, индуцировали прямой соматический эмбриогенез в различных эксплантах, причем наилучшими оказались гипокотиль. Zapata-Castillo и др. (2007), работая с различными культуральными средами и типами эксплантов, индуцировали соматический эмбриогенез C. chinense из суспензии эмбриогенных клеток. Онтогенез прямого высокочастотного соматического эмбриогенеза C. chinense, индуцированного из гипокотилей, был охарактеризован с помощью гистологического анализа (Santana-Buzzy et al., 2009). Проэмбриогенные клетки происходили из проваскулярных клеток гипокотиля.
Культура растительных тканей для перца. Улучшение сельскохозяйственных культур
Выражение уже существующей вариации в растениях может быть стимулировано, а вариация de novo может быть индуцирована. В регенерированных растениях наблюдаются отклонения от типа, это непредсказуемое явление называется сома-клональной вариацией (Larkin and Scowcroft, 1981). Культура тканей растений предоставляет методы и процедуры, с помощью которых можно генерировать генетические вариации или выражать уже существующие вариации в клетках. Brar и Jain (1998) провели обзор сомаклонального феномена у растений и обнаружили, что сомаклональная вариация присутствует почти у всех видов и влияет на многие признаки растений. Capsicum не стал исключением (Hossain et al., 2003; Valadez-Bustos et al., 2009).
Сомаклональная изменчивость у перца
В культуре in vitro могут происходить изменения в ДНК клеточных ядер, внехромосомные или эпигенетические, в результате чего особи проявляют различия в уровнях признаков: морфологических, биохимических или последовательностей ДНК. Источник сомаклональной вариации и степень вариации у перца зависит от генотипа, источника эксплантов, состава культуральной среды, типа и концентрации регуляторов роста, баланса регуляторов роста, морфогенетического пути и других специфических соединений или комбинации всех этих факторов (Brar and Jain, 1998). Литература по сомаклональным вариациям у перца чили скудна. Кристофер и Раджам (1994) регенерировали растения C. annuum и C. praetermissum путем прямого органогенеза; проведенный ими цитогенетический анализ выявил хромосомные аберрации, задержки хромосом и анафазные мосты. Сомаклональные вариации можно различать по морфологическим признакам (Maralappanavar et al., 2000) и с помощью анализа случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) (Chen et al., 1998). Tomaszewska-Sowa et al. (2002), работая с генотипами сладкого перца, доказали, что прямое регенерация побегов снижает вероятность сомаклональной вариации, поскольку цитокинины, присутствующие в исходной среде, не нарушают митоз и не вызывают изменений в плоидности регенерантов. Метилирование ДНК связано с рядом наследуемых, но потенциально обратимых эпигенетических изменений. Успешное использование сомаклональных вариаций для улучшения сельскохозяйственных культур частично зависит от их генетической стабильности в последующих поколениях (Jain, 2001). Хоссейн и др. (2003) оценили морфологические и генетические вариации в сомаклонах перца чили, полученных из культуры ткани. Генетические вариации между сомаклонами были выявлены с помощью RAPD-анализа. Valadez-Bustos et al. (2009) оценили поколение Ro, полученное путем органогенеза генотипов C. annuum и C. chinense на основе вегетативных, фено-логических и агрономических признаков. Исследование сомаклональной изменчивости, полученной в результате различных методов регенерации, показало, что регенеранты C. chinense, полученные путем соматического эмбриогенеза, демонстрируют большую изменчивость в моделях ДНК, проанализированных с помощью молекулярных маркеров RAPD и ISSR (Santana-Buzzy).
Гаплоидная культура
Разведение гаплоидных растений более эффективно, чем обычное разведение растений, для получения диплоидных гомозиготных чистых линий. Культура яйцеклеток, завязей, микроспор или пыльников является полезным инструментом для получения F1 гибридов из диплогаплоидных линий в один этап. Линии, полученные таким образом, гомозиготны по всем генам (чистые линии) и находят применение в селекции растений (Bhojwani and Razdan, 1997). Ванг и др. (1973) первыми сообщили о культуре пыльников перца чили и регенерации гаплоидных растений. Пыльники с микроспорами на стадии неоплодотворения культивировали на среде MS, модифицированной микроэлементами и витаминами, с добавлением Kin, NAA или 2,4-D. Другие авторы сообщали о регенерации гаплоидных растений из культуры пыльников видов и гибридов Capsicum (George and Narayanaswamy, 1973; Kuo et al., 1973; Novak, 1974; Wang et al., 1981; Sibi, 1982; Morrison et al., 1986; Kristiansen and Andersen, 1993; Gyulai et al., 2000; Koleva- Gudeva et al., 2007). Спонтанные гаплоиды были зарегистрированы у видов Capsicum (Christensen and Bamford, 1943; Pochard and Dumas de Vaulx, 1979).
Sibi и др. (1982) разработали более успешный протокол культуры пыльников у перца, который был в дальнейшем оптимизирован Dumas de Vaulx и др. (1982). Регнер (1996) изучал непосредственно изолированную культуру микроспор болгарского перца, но не смог разработать успешный протокол культуры. Ким и др. (2008) сообщили о высокой частоте получения эмбрионов и регенерации растений с помощью изолированной культуры микроспор острого перца. Несмотря на свою важность, было проведено мало исследований для получения гаплоидных проростков у генотипов острого перца, которые менее отзывчивы на культуру пыльников. Однако Супена и др. (2006) разработали эффективный метод получения удвоенных гаплоидов для селекции острого перца.
Генетическая трансформация перца чили
Генетическая трансформация растений стала мощным инструментом для молекулярных исследований и улучшения сортов. Наиболее распространенные методы генетической трансформации растений, использующие Agrobacterium tumefaciens, с наибольшим успехом применяются для большого числа видов растений, включая однодольные и двудольные культуры. Что касается перца, то он остается крайне невосприимчивым как к размножению in vitro, так и к трансформации, опосредованной A. tumefaciens. Несмотря на то, что первые результаты по их генетической трансформации были опубликованы (Liu et al., 1990), методы, о которых сообщается в научной литературе, редко бывают последовательными и воспроизводимыми (Kothari et al., 2010). Перечная «рекальцитрантность» представляет собой значительное препятствие не только для применения современных биотехнологий, но и для развития исследований в области функциональной геномики.
Перспективы
Коллекции культивируемых и дикорастущих видов Capsicum хранятся примерно в 20 странах мира. Фенотипическая и молекулярная характеристика образцов в этих коллекциях остается серьезной проблемой для полного использования имеющегося генетического разнообразия. Высокопроизводительное генотипирование открывает новые возможности для характеристики зародышевой плазмы. Используя относительно небольшую часть имеющейся зародышевой плазмы, генетики и селекционеры накопили обширные знания о просто наследуемых генах Capsicum. Многие из этих генов кодируют ферменты в биосинтетических путях для первичных или вторичных метаболитов. Сохранение генов, кодирующих ферменты, и интенсивные исследования в области геномики и метаболомики у родственных пасленовых и неродственных видов будут и дальше способствовать открытию генов у Capsicum. По сравнению с репертуаром известных структурных генов, идентичных и функционирующих у Capsicum, требуется значительно больше исследований для углубления наших знаний о связанных регуляторных элементах и понимания экспрессии генов, специфичных для тканей или развития. Картирование новых просто наследуемых и сложных локусов увеличит разрешение карт сцепления на основе маркеров и, в свою очередь, продолжит развивать наши знания о сложных признаках. Изучение влияния основных QTLs, аддитивных эффектов второстепенных QTLs и взаимодействия генов выиграет от добавления новых маркеров. Несмотря на огромный рост возможностей и скорости секвенирования ДНК, технологии, способствующие высокопроизводительному фенотипированию, по-прежнему ограничивают скорость исследований генетических связей, анализа функций генов и валидации маркеров. Анализ экспрессии генов в масштабах всего генома вместе со стратегиями байесовского обучения открывает новые возможности для понимания сложных вопросов селекции, в частности, взаимодействия генотип-среда. Эти новые технологии обещают способствовать улучшению устойчивости перца к болезням и вредителям, эффективности использования воды, урожайности и качества плодов. Селекционеры служат связующим звеном в переводе этого богатства новых данных в решения для улучшения урожая.
Исследования и разработки в области биотехнологии за последние два десятилетия дали практические результаты, доказывающие полезность культуры клеток и тканей в селекции перца (Fari, 1995). Культура клеток и тканей in vitro стала эффективным средством селекции на устойчивость, одновременно повышая урожайность и качество перца. Соматический эмбриогенез приобрел такое значение благодаря своей полезности в качестве инструмента для изучения зиготического эмбриогенеза, а также как адекватная система для массового размножения растений при интеграции с обычной программой селекции и методами молекулярной и клеточной биологии. Соматический эмбриогенез представляет собой ценный инструмент для повышения темпов генетического улучшения. Широкое применение соматического эмбриогенеза в фундаментальных и прикладных исследованиях побудило провести исследования по определению условий in vitro для индукции соматических эмбрионов и их превращения в растения у Capsicum. Некоторые изменения, полученные in vitro, могут быть использованы в качестве источника новых вариаций, которые впоследствии могут быть включены в селекционные программы или использованы для выведения новых сортов с важными агрономическими или экономическими признаками (Bridgen, 1996). Культура тканей в сочетании с молекулярными методами была успешно использована для включения специфических признаков путем переноса генов.
Генетическая трансформация открывает большие перспективы для смягчения основных ограничений продуктивности сельскохозяйственных культур. Генетическая манипуляция — это привлекательное предложение, которое включает в себя рекомбинацию эффективной системы регенерации клеточной или тканевой культуры с технологией рекомбинантной ДНК. Эта технология оказалась очень полезной при переносе специфических генов из других таксонов или изменении экспрессии специфических местных генов. Это позволит Capsicum достичь сравнительных показателей эффективности трансформации, достигнутых для других важных культур. Переходная трансформация с использованием A. tumefaciens может стать ценным инструментом для изучения функций генов перца в гомологичной системе.
Будущие перспективы применения биотехнологических инструментов многообещающи для Capsicum, особенно для новых гибридов, выведенных с помощью культуры тканей и биотехнологических методов. Растет ожидание, что биотехнологическая индустрия предоставит второе поколение трансгенных продуктов для более сложных признаков, связанных с урожайностью и стабильностью урожая, которые находятся под сложным полигенным контролем. Серьезная неподатливость рода Capsicum к культуре in vitro была основной причиной ограниченного прогресса в использовании этих методов. Тем не менее, имеются значительные успехи в разработке органогенных и эмбриогенных систем для регенерации растений перца чили in vitro. Прогресс, достигнутый в последние годы в области Capsicum, способствовал лучшему пониманию явления рекальцитранса. Эти знания дадут беспрецедентную возможность определить регуляторные гены и сети, контролирующие события для эффективного получения нормальных растений Capsicum при размножении in vitro.
Литература
Bosland, Paul W. Peppers : vegetable and spice capsicums / Paul W. Bosland and Eric J. Votava. — 2nd ed. 2012.
Peppers : botany, production and uses/Vincent M. Russo, editor. 2011.
