Генетика томата

Основная страница: Томат

Среди цветковых растений томат исключительно хорошо подходит для генетических и цитогенетических исследований. Несмотря на относительно высокое гаплоидное число хромосом (12), его основным достоинством для таких целей является диплоидная природа (Rick, 1971a). Обильное взаимодействие между генетикой томата и селекцией томата привело к большой взаимной выгоде, и многие исследования объединили обе области. Многие полезные материалы по генетике томата были предоставлены селекционерами томата, и наоборот, исследования в области базовой генетики томата позволили достичь значительного прогресса в селекции.

[toc]

Генетическая изменчивость в пределах Solanum L. sect. Lycopersicon

Культурный томат достиг своей нынешней формы и места в рационе/образе жизни человека после многих веков одомашнивания. Первоначальное развитие, вероятно, было достигнуто путем отбора предпочтительных генотипов в существующей зародышевой плазме. В видах с преобладанием инбридинга генетическая изменчивость имеет тенденцию к снижению даже без отбора. Томат пострадал от серьезных генетических узких мест за последние 600 лет, когда эта культура была перенесена из Нового Света в Европу, а затем обратно в Северную Америку, где были начаты программы селекции с использованием материалов, доступных в этих регионах. Как следствие, генетическая вариативность культивируемых видов томатов всегда считалась крайне ограниченной. Вполне вероятно, что до 20-го века не проводилось целенаправленных скрещиваний с родственными дикими видами.

Отсутствие разнообразия иллюстрируется повторным секвенированием различных сортов томатов. Недавно были разработаны методы, позволяющие получить большое количество информации о последовательности (секвенирование следующего поколения (NGS)). Несмотря на десятки тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), которые были выявлены при сравнении последовательностей сортов (Tang et al., 2006; Sim et al. 2012a,b; Viquez-Zamora et al., 2013), уровень вариаций, обнаруживаемых на уровне ДНК, является низким по сравнению с другими культурами, такими как кукуруза и картофель. Однако эти SNP могут объяснить богатую морфологическую вариацию, наблюдаемую среди сортов томата (Solanum lycopersicum).

Мутанты

До недавнего времени томаты выращивались как самоопыляемые сорта. Спонтанные или индуцированные мутанты, создающие необычные фенотипы, легко обнаруживаются у самоопыляющихся видов. Такие мутанты у томата были тщательно задокументированы, сохранены и размножены. Рецессивные точечные мутации становятся заметными после самоопыления. Эти мутанты часто ассоциируются с очевидными отклоняющимися фенотипами. Большая популяция отклоняющихся фенотипов, наблюдаемая в банках генов или в генетическом фонде селекционера, показывает обильную вариабельность (Rick, 1991). Некоторые из этих мутантов были использованы для улучшения сельскохозяйственных культур. С 1950-х по 1980-е годы изучались родственные связи многих мутантов, в результате чего была составлена морфологическая карта томата. Эта карта, более поздние молекулярные карты и опубликованная последовательность томата (Tomato Genome Consortium, 2012) доступны в базе данных Solanaceae Genomics Network (http://solgenomics.net/).

Основным материалом для генетики томатов являются мутантные гены. Самые ранние доступные варианты были обнаружены в сортовых сортах как сортовые признаки или как спонтанные мутанты. Этот источник изменчивости продолжает поставлять ценную зародышевую плазму для фундаментальных и прикладных исследований. После открытия индуцированных мутаций репертуар моногенных вариантов томата значительно расширился. Почти 300 новых мутантов L. esculentum были индуцированы и описаны Стаббе, и еще 200 — у очень близкородственного и генетически близкого L. pimpinellifolium. Дополнительные мутанты были получены с помощью быстрых нейтронов, гамма-излучения, этиленамина и этиленметионинсульфоната (EMS). Последние дополнения к списку мутантов томата — это аллозимы примерно по 30 локусам (Rick, 1983); также были идентифицированы варианты не менее чем по десяти дополнительным локусам. Почти все варианты аллозимов были найдены в диких таксонах, культивируемые формы крайне ограничены в этом классе генетической изменчивости. Эти мутанты способствовали развитию генетических исследований томата не только за счет увеличения количества полезных маркеров, но и за счет более эффективного скрининга и измерения сцепления. Превосходство аллозимов над обычными морфо-физиологическими маркерами для этих и других целей рассматривается ниже.

Общее число доступных моногенных мутантов в настоящее время (1985 г.) оценивается в 1200. Большинство из них, вместе с хромосомными вариантами и видовыми образцами, поддерживаются и распространяются Центром генетических запасов томатов, Департамент овощных культур, Калифорнийский университет (Дэвис, Калифорния, 95616, США). Доступные запасы этих фондов периодически перечисляются в отчетах Кооператива генетиков томата.

Все картированные гены перечислены в E.H. Roberts THE TOMATO CROP
A scientific basis for improvement стр. 51. Хотя это далеко не все гены, известные для томата, эта группа представляет собой достаточно хорошую выборку из большого разнообразия модификаций, которые, как известно, сегрегационно моногенны. Поскольку томат ведет себя как базовый диплоид, в его фенотипе можно четко определить мутации многих типов. Наиболее распространенными являются модификации формы, размера и цвета листа. Сегментированный лист томата допускает мириады обнаруживаемых изменений в количестве и подразделениях его сегментов, текстуре поверхности, краевой конформации, угле отхождения от стебля, узорах жилкования, остроте кончиков сегментов и других аспектах. Культивар Marglobe служит стандартным или нормальным (+) типом, по сравнению с которым мутанты получают названия и обозначения.

Дикие виды томата

На данный момент известно 13 видов, относящихся к роду Solanum секции Lycopersicon. Solanum pimpinellifolium, S. cheesmaniae и S. galapagense находятся в одной группе с S. lycopersicum. Все они скрещиваются, а уровень различий в ДНК между S. galapagense и S. cheesmaniae крайне низок (Viquez- Zamora et al., 2013). Между томатом и S. chmielewskii, S. habrochaites, S. neorickii и S. pennellii обнаружено гораздо больше различий в последовательности, но они все еще скрещиваются с томатом. Остальные пять видов (S. arcanum, S. chilense, S. cor- neliomulleri, S. huaylasense и S. peruvianum) труднее скрещивать с томатом, но часто такие методы, как спасение эмбрионов, делают скрещивание возможным.

Разнообразие среди и внутри диких видов Solanum L. sect. Lycopersicon

Отсутствие генетического разнообразия в культивируемом томате не является препятствием для достижения прогресса в селекции томата, так как существует большое разнообразие, легко доступное в диких родственниках томата. Различия между видами внутри рода Solanum L. sect. Lycopersicon огромна.

Изменчивость плодов томата
Изменчивость плодов томата
Изменчивость плодов томата
Изменчивость плодов томата

В многочисленных исследованиях изучались специфические признаки, присутствующие у родственных диких видов, которые используются для улучшения томатов. Почти все дикие виды внесли ценные признаки для улучшения сельскохозяйственных культур, начиная с близкородственных красноплодных самоопыляющихся видов S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae и S. galapagense до более отдаленно родственных зеленоплодных самонесовместимых видов S. pennellii и S. arcanum.

Верхние листья томата (Solanum lycopersicum) и его ближайших родственников
Верхние листья томата (Solanum lycopersicum) и его ближайших родственников: I - S. Iycopersicum; II - S. pimpinellifolium; III - S. cheesmaniae; IV - S. galapagense

Скрещивания иногда бывают легкими, но иногда и более сложными, например, скрещивания между S. lycopersicum и S. chilense или S. arcanum. Эти скрещивания часто требуют спасения эмбрионов для получения потомства F1. Кроме того, в последующих поколениях дополнительные барьеры, вызванные генетическими взаимодействиями, могут препятствовать дальнейшему прогрессу, например, при создании рекомбинантных инбредных линий (RILs).

Скрещивание томатов
Скрещивание томатов. (A) Эмаскуляция женского родителя. (B) Сбор пыльцы. (C) Скрещивание. (D) Маркировка.

Благодаря самонесовместимости и способу размножения, ауткроссирующие виды имеют более высокий уровень генетической изменчивости, чем самоопыляющиеся виды. Miller и Tanksley (1990) оценили эту изменчивость с помощью молекулярных маркеров. Поразительно, что в пределах одного экземпляра самонесовместимого вида наблюдалось больше генетических различий, чем во всех экземплярах любого из самонесовместимых видов.

Для того чтобы использовать родственные дикие виды томата для введения новых благоприятных признаков, необходимы генетические исследования и выявление тесно связанных молекулярных маркеров с интересующим геномом(ами). Для этого необходимы сегрегационные популяции, полученные в результате скрещивания двух родителей с различиями по интересующему признаку. Наиболее распространенными популяциями для анализа локусов количественных признаков (QTL) являются F2 (популяция, полученная после самоопыления гибрида) или BC1 (популяция, полученная после скрещивания гибрида с одним из родителей). RILs как постоянная популяция может быть изучена на один или несколько интересных признаков в различных условиях с большим количеством повторов. Однако эффективность обнаружения конкретного QTL в сегрегационной популяции все еще низка, частично потому, что другие QTL сегрегируют, и крупные QTL маскируют мелкие. По этой причине Эшед и Замир (1994) предложили использовать библиотеки линий интрогрессии (IL). Популяция IL состоит из серии линий, несущих уникальный сегмент от дикого потомка, интрогрессированного в однородный, культивируемый генетический фон. В идеале, все линии вместе представляют полный геном дикого предшественника. До сих пор сообщалось о нескольких популяциях IL, полученных от S. pennellii LA716 (Eshed and Zamir, 1994), S. habrochaites LA1777 (Monforte and Tanksley, 2000), S. habrochaites LA407 (Francis et al., 2001), S. habrochaites LYC4 (Finkers et al., 2007) и S. chmielewskii LA1840 (Mathieu et al., 2009). В дополнение к видам внутри Solanum L. sect. Lycopersicon, интрогрессии были сделаны с Solanum lycopersicoides и S. sitiens (Canady et al., 2005; Ji et al., 2004).

В заключение следует отметить, что генетическая изменчивость культивируемых видов томатов ограничена, но существует значительная генетическая изменчивость среди и внутри диких скрещивающихся видов, которую можно использовать, с разной степенью сложности, для улучшения урожая. Селекционеры, естественно, будут использовать источники, наиболее близкие к культивируемому томату, для простоты, эффективности и быстроты передачи. Однако ни один из видов не является недосягаемым для селекции при наличии достаточного времени, труда и ресурсов.

Сбор и сохранение генетических ресурсов

Сбор, описание, размножение и распространение генетических материалов имеют огромное значение для селекции томатов. Во второй половине 20-го века были проведены многочисленные экспедиции в регион Анд для сбора образцов различных диких видов томатов. Следует отметить доктора Чарльза Рика из Калифорнийского университета, который понимал важность сбора зародышевой плазмы (Rick, 1991). Он собрал и описал многочисленные образцы диких видов из рода Solanum L. sect. Lycopersicon, которые до сих пор хранятся в Центре генетических запасов в Дэвисе, Калифорния. Эти материалы доступны по запросу для научного сообщества, а также для коммерческой селекционной индустрии. Зародышевая плазма томата хранится в нескольких других мировых генных банках. Конвенция Рио-де-Жанейро о биологическом разнообразии строго регламентирует сбор новой зародышевой плазмы, чтобы добиться справедливого и равноправного распределения выгод от генетических ресурсов.

В рамках генного банка образцы должны быть полностью и точно описаны. Помимо информации о месте произрастания, полных паспортных данных и таксономической классификации, сюда входят данные о родной среде обитания, географических и климатических характеристиках. Морфология, такая как форма листьев, характер роста растений, размер и форма плодов, также являются важными описателями. Кураторы несут ответственность за поддержание изменчивости в пределах доступа. Для размножения и поддержания ауткроссинга самонесовместимых сортов требуется больше растений по сравнению с самосовместимыми. Трудно гарантировать, что при размножении не будут потеряны особые признаки из-за генетического дрейфа. Характеристики абиотического и биотического стресса, такие как толерантность к соли, грибковым патогенам и насекомым-вредителям, также могут быть включены. Оценка этих признаков стоит дорого, а генные банки, как правило, не получают достаточного финансирования. Поэтому этих данных не хватает, и исследователей просят поделиться результатами своих оценок. К сожалению, исследователи не всегда чувствуют себя морально обязанными сделать это. Рассматривая вопрос об использовании дикой зародышевой плазмы для улучшения сельскохозяйственных культур, следует отметить, что полезные гены диких видов в секции Solanum L. sect. Lycopersicon могут быть замаскированы. Например, мелкоплодный дикий вид S. pimpinellifolium имеет гены, которые потенциально могут увеличить размер плодов, если эти гены присутствуют в фоне культурного томата (Monforte and Tanksley, 2000).

Цитогенетика

Большая часть исследований по цитогенетике томатов была проведена в 1960-х годах и обобщена Гиллом (1983). Полные наборы первичных трисомиков были получены из автотриплоидов на нескольких фонах, также были получены модифицированные трисомики тело, вторичного, третичного и компенсационного типов. Из всех трисомических типов телотрисомики, вероятно, наиболее полезны, поскольку они наименее сложны в поддержании и в генетических тестах ограничивают ген не только соответствующей хромосомой, но и ее плечом. Новой разработкой в области анеуплоидии томатов является исследование Ramulu et al. (1977) потомства от триплоидного к диплоидному скрещивания в L. peruvianum. Трипло-1 и трипло-3 были идентифицированы среди первичных трисомиков, образовавшихся таким образом. Самофертильность этих анеуплоидов была объяснена изменениями самонесовместимости стиларов (SI), а не конкурентным взаимодействием в пыльце. Взаимные транслокации были синтезированы несколькими специалистами; Гилл и др. (1980) перечислили 36 имеющихся типов. Перестановки у томата примечательны тем, что 80% точек разрыва находятся либо в центромере, либо в перицентрической гетерохроматине, что свидетельствует о непропорционально высокой склонности этих регионов к разрывам. Исследования на томате внесли большой вклад в наши знания об анеуплоидии в целом (Khush, 1973).

Что касается эуплоидных вариантов, то были исследованы гаплоиды, автотриплоиды и автотетраплоиды. Гаплоиды встречаются относительно редко; многие исследователи потерпели неудачу в своих попытках получить их с помощью различных процедур. Полиэмбриония, которая является таким плодовитым источником гаплоидов у Capsicum,
Triticum, Asparagus и других родов растений, происходит с такой низкой скоростью, что это не является реальным источником гаплоидов томата; более того, попытки повторить методы, которые, как сообщалось, были успешными (перечисленные Риком, 1975), постоянно терпели неудачу. Напротив, автотриплоиды распространены как спонтанные, неплодоносящие варианты на производственных полях. Автотриплоиды могут быть найдены, хотя и реже, в том же источнике, и легко индуцируются обработкой колхицином. Плохая всхожесть семян, замедленный рост и высокая стерильность мешают использованию линий 4x как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Читатель может обратиться к Gill (1983) за более полным изложением этой темы со ссылками и полными списками известных и доступных цитологических девиантов.

Все исследования хромосомных девиантов подтвердили основную диплоидную природу генома томата. Пределы допустимого хромосомного дисбаланса относительно невелики. Так, одна лишняя хромосома вызывает резкие морфологические изменения и переменное снижение жизнеспособности и плодовитости; две лишние хромосомы сильно тормозят развитие; а три лишние хромосомы — это верхний допустимый предел, и то только для некоторых меньших хромосом комплемента. Дефицит целых хромосом переносится только для трех из меньших членов генома, и ни один эухроматический дефицит любого размера не был обнаружен, чтобы быть переносимым в гаметогенезе ни с мужской, ни с женской стороны. По этой причине индуцированные дефициты полезны только для поколения, в котором они были получены — это «одноразовые» биотипы, которые могут поддерживаться только путем вегетативного размножения.

Томат имеет диплоидный геном с 12 парами хромосом. На стадии пахитены хромосомы томата очень четкие, их можно отличить по длине и рисунку полос. Общая длина хромосом томата на стадии метафазы составляет около 50 мкм.

Гаплоидное производство томата пока недоступно, хотя некоторые сообщения указывают на возможность такого производства (патент: Tomato anther culture, US 4835339; Zagorska et al., 1998; Chambonnet, 2012). Гаплоиды полезны для быстрого скрининга роли рецессивных аллелей, влияющих на определенный признак. Однако процент успешного получения гаплоидов у томата крайне низок, поэтому гаплоидизация не используется ни в научных исследованиях, ни в практической селекции.

Скрещивание диплоида с тетраплоидным генотипом может привести к образованию триплоидов. Триплоиды и тетраплоиды, а также анеуплоиды получаются из потомства триплоидов.

Тетраплоиды характеризуются более толстыми и темными листьями, уменьшенной длиной междоузлий, увеличенной толщиной стебля и сниженной плодовитостью, а также сниженной закладкой плодов и качеством плодов. Следовательно, тетраплоидные томаты не пригодны для коммерческого использования. Это справедливо и для всех других недиплоидных томатов.

В настоящее время расположение уникальных последовательностей ДНК можно визуализировать с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). FISH может помочь в решении проблем с получением последовательностей в правильном порядке (Szinay et al., 2008), и хромосомные перестройки могут быть визуализированы среди различных видов Solanum. FISH часто использовался для отнесения больших участков ДНК к определенным хромосомам томата. Это сыграло важную роль в сборке полной последовательности генома томата (Tomato Genome Consortium, 2012).

Перестройки, такие как инверсии, могут быть причиной холодных точек рекомбинации и, следовательно, затягивания сцепления, которое не может быть минимизировано дальнейшими скрещиваниями.

Сцепление

Томат является одним из классических организмов для изучения сцепления. Исследования в этой области восходят к анализу Джонсом (1917) результатов Хедрика и Бута (1907) по косегрегации d-o. В первые годы прогресс был медленным, поскольку было доступно мало маркеров, а единственные данные были получены из сегрегаций BC и F2. Позднее исследования ускорились благодаря применению цитогенетических методов с реципрокной транслокацией, различных классов анеуплоидов и индуцированных дефицитов, а также накоплению множества маркеров. Цитогенетические процедуры служили для разграничения маркеров по соответствующим хромосомам, рукавам и даже по ограниченным регионам в рукавах. После создания такой структуры с полезными маркерами во всех эухроматических рукавах были синтезированы подходящие запасы тестеров сцепления. После этого сцепления непроверенных генов можно было наиболее эффективно искать путем скрещивания либо с морфологическими тестерами, либо с несколькими аллозимными тестерами с последующим стандартным анализом BC или F2. Сцепления у томата были обобщены (Rick, 1975, 1980a, 1982b).

Карты на рис. представляют собой попытку обновить ситуацию. Неизбежно возникают расхождения между различными определениями одного и того же интервала; в таких ситуациях значения на рис. являются компромиссами. Так, в длинном плече хромосомы 2 порядок и расстояния условны и, несомненно, потребуют пересмотра в будущем. Керр (1982a) обнаружил, что большая группа маркеров находится на хромосоме 1, но их интеграция с другими известными маркерами не была завершена. Что касается длинного плеча хромосомы 10, Керр указывает, что локусы на рис. несколько неопределенны. Также сомнения относительно локусов многих членов серии Cf потребовали их исключения из карт (Kerr, 1982b). Всего 323 гена были приписаны к соответствующим хромосомам; из них локусы 234 были приблизительно представлены на рис., остальные 89, для которых еще не были проведены окончательные многоточечные тесты, перечислены под каждой хромосомной картой.

Карта сцепления
Карта сцепления томата. Пересмотренная карта сцепления томата. Расположение центромер обозначено символами O'. Гены, отнесенные к хромосомам, но не расположенные по тестам множественных точек, перечислены под каждой хромосомой.

Наиболее значительным прогрессом в установлении связей томатов стало использование изозимных локусов. Некоторые из их преимуществ перед обычными маркерами следующие: (1) кодоминантность, (2) однозначное фенотипическое выражение, (3) отсутствие эпистаза, (4) отсутствие влияния на морфологию и жизнеспособность растений, и, следовательно, (5) возможность накопления большого количества маркеров в одной породе (Tanksley and Rick, 1980b). Побочными результатами связывания изозимных локусов являются несколько недавних применений в фундаментальных и прикладных исследованиях, которые обсуждаются в разделе о селекции томатов.

Связи между изозимными локусами и количественными признаками были изучены Tanksley, Medina-Filho и Rick (1982). В скрещивании L. esculentum и L. pennellii они исследовали косегрегацию 12 изозимных локусов и четырех количественных признаков. Как и ожидалось, метод позволил получить минимальную оценку числа локусов, определяющих метрические признаки, а также составить их карту, хотя и грубую. Совершенно неожиданным оказался ряд других преимуществ, включая обнаружение аллелей метрических признаков с противоположными эффектами от одного и того же родителя. Оценки степени трансгрессивной сегрегации, ожидаемой таким образом, хорошо соответствовали наблюдаемым значениям. Еще одним бонусом было обнаружение эпистаза между локусами метрических признаков. Одновременная сегрегация всех признаков в одном потомстве, допускаемая неэпистатическими и доброкачественными аллозимами, была проанализирована в парных сравнениях локусов для различных метрических признаков. Были обнаружены не только случаи межколичественного эпистаза локусов признака, но и взаимодействие аллелей дополнительных локусов, не выявленных при однолокусном анализе.

Поскольку различные цитогенетические особенности карт томатов были кратко представлены в работе Gill (1983), здесь они будут представлены лишь вкратце. Неслучайность распределения маркеров была обнаружена в отношении распределения (1) между хромосомами, (2) между рукавами и (3) внутри рукавов. Что касается общего содержания хроматина или эухроматина, хромосома 5 содержит непропорционально меньше, а хромосома 11 — больше локусов, чем ожидалось. Полностью гетерохроматический рукав 2S не имеет маркеров, но, несомненно, богат рибосомными цистронами.

В том же ключе, nv является единственным картированным геном, расположенным в гетерохроматине. Популяция генов перицентрических регионов кажется непропорционально большой, а в дистальном эухроматине обнаруживаются обширные пробелы или «молчащие регионы». Определенная степень неслучайности существует даже в отношении маркерных фенотипов: примеры можно найти в карликовой серии на хромосоме 2, перевитой серии на 7 и жилистой серии на 4 (Rick, 1971a). Очень тесные связи между изозимными локусами с очень похожими фенотипами были зарегистрированы для Prx-2,3 (Rick^ Tanksley and Fobes, 1979) и серии Est-1,5,6,7 (Tanksley and Rick, 1980a). Возможно, эти изозимные комплексы возникли в результате дупликации путем неравного перекреста.

Помимо исследований, направленных в первую очередь на картирование, заслуживает упоминания доклад о регуляции перекреста. Sibi, Biglary и Demarly (1984) проверили влияние регенерации из культуры тканей на рекомбинацию в интервале bs- ms-32 на хромосоме 1 и в aa-d на 2. Средняя скорость рекомбинации была увеличена по сравнению с контролем на 13% для первого интервала и на 11% для второго. В потомстве некоторых регенерантов первой группы наблюдалось значительное увеличение на 19-26%, второй — на 31-35%. Причину этих наблюдаемых изменений можно только предполагать, но одна из альтернативных гипотез состоит в том, что показатели могут быть увеличены в определенных регионах за счет компенсации снижения в других, вызванного хромосомной структурной гибридностью — хорошо известным явлением у дрозофилы. В потомстве сомаклонального размножения кукурузы и картофеля наблюдалось много хромосомных поломок.

Молекулярные карты сцепления

Первоначально морфологическая карта томата была создана на основе визуально различимых морфологических признаков. Поэтому она была построена на основе данных многочисленных анализов сцепления, большинство из которых было основано на сегрегации от трех до шести маркеров. Позже различные формы изозимов могли быть идентифицированы и добавлены к морфологической карте (Tanksley and Mutschler, 1990). Эти изозимы считаются первым поколением молекулярных маркеров. Изначально изозимы внесли большой вклад в исследования по картированию; однако ограничение изозимов как молекулярных маркеров заключается в том, что они представляют лишь ограниченное число локусов, а методы разделения белков дороги и не отличаются высокой пропускной способностью. Поэтому изозимы больше не используются.

С появлением молекулярных маркеров на основе ДНК можно было создавать генетические карты высокой плотности, используя данные только одной сегрегационной популяции. Первая карта высокой плотности была опубликована в 1991 году (Tanksley et al., 1992). Эта карта содержала 1030 ДНК-маркеров (полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов (RFLPs)). Большинство этих маркеров потенциально полезны в любой сегрегационной популяции в пределах Solanum L. sect. Lycopersicon. Это связано с тем, что порядок этих маркеров сохраняется у всех видов Solanum L. sect. Lycopersicon. Генетическое родство томата с другими более отдаленно родственными видами, такими как картофель, перец и баклажан, было изучено путем сравнения генетических карт сцепления. Карта томата очень похожа на карту картофеля, но отличается от карты перца (Wu et al., 2009). Сходство между геномами родственных Solanaceae позволяет сравнить положение на карте сходных генов. Действительно, положение генов на карте и репертуар генов, по-видимому, также являются консервативными. Все эти данные указывают на древнего общего предка этих родственных видов Solanaceae. 

Ландшафт технологии молекулярных маркеров изменился с беспрецедентной скоростью. Возможность получения большого количества информации о последовательностях при относительно низких затратах сделала возможным сравнение последовательностей и поиск различий между ними (Tang et al., 2006; см. также http://www.bioinformatics.nl/tools/snpweb). Для генотипирования популяций были разработаны другие высокопроизводительные методы, требующие лишь небольшого количества ДНК. Это делает SNP маркером выбора в настоящее время, и SNP облегчают создание карт высокой плотности в любом интересующем регионе. Международные корпорации также сосредоточены на выявлении белковых и метаболических «отпечатков пальцев» томата. Вместе с информацией о последовательности ДНК эта область исследований называется геномикой. Ожидается, что эти разработки приведут к важному шагу вперед в наших знаниях и понимании структуры генома томата. Проблема будет заключаться в том, как эффективно интерпретировать и использовать все информационные ресурсы. Биоинформатика будет играть в этом важную роль.

Мутация

Химический мутагенез был использован со значительным успехом для создания вариантов для конкретных целей. В качестве примера можно привести K-неэффективный мутант (Epstein, 1979).

Генетические и цитогенетические вариации также могут быть вызваны определенными сомаклональными процедурами. Нестабильность культур тканей растений хорошо известна. При определенных режимах в культурах клеток томатов обычно достигается высокий уровень плоидности. Способность культур тканей томата генерировать моногенные мутанты была продемонстрирована Эвансом и Шарпом (1983). Культуры были созданы из эксплантов листьев сорта UC82B, и из полученных таким образом краткосрочных каллусных культур были получены целые растения, которые самоопылялись и выращивались потомки второго поколения. Наблюдалась моногенная сегрегация для различных мутаций, среди которых один мутант с фенотипом t оказался аллелем этого локуса.

В другом эксперименте культуры пыльников клона L. peruvianum дали новый 5 аллель (Ramulu, 1982). Этот аллель проявил специфичность, ранее неизвестную в обширном опыте автора и de Nettancourt
и др. (1975). Доминирование, обнаруженное в новом аллеле, показывает любопытный переход от гаметофитного к спорофитному контролю SI. Наблюдения совместимы с гипотезой происхождения аллеля, основанной на рекомбинации между родительскими комплексами аллелей.
Lycopersicon peruvianum, благодаря своей превосходной способности к регенерации, был также средой для исследования влияния культуры тканей на число хромосом (Ramulu et al., 1976). В данном исследовании регенерация была получена из пыльников и междоузлий стебля. Регенерация не была получена из автотетраплоидных культур. Среди 82 растений, регенерированных из диплоидных источников, были выявлены диплоидные, тетрапиоидные и химерные (2x-4x комбинации периклинального и мериклинального типов) растения.

В категории часто мутирующих или вечно мутирующих генов можно привести два возможных примера из литературы по томатам. В качестве одного из примеров можно привести парамутацию сульфа, которая продолжает оставаться интригующей стороной современной генетики томатов. Хагеманн и Берг (1978) продемонстрировали, что частые реверсии sulf в + происходят в течение первых нескольких поколений клеток после прорастания семян, причем частота парамутации быстро снижается с каждым последующим поколением клеток. Следствием этого ограничения является появление больших и четко очерченных секторов парамутантной ткани.

Следующий странный феномен мутации S-аллеля у L. peruvianum, возможно, также относится к этой категории. По данным de Nettancourt et al. (1975), инбредные потомки одного клона с генотипом 5152 имеют тенденцию давать новых мутантов по этому локусу, но всегда к одному и тому же S3 аллелю, как определено по специфичности SI. Похоже, что S2 более склонен к мутации, чем S1. Также наблюдались редкие возвраты, во всех случаях от S3 к S2. Хотя фундаментальная природа этих изменений не вполне понятна, гипотеза, основанная на перекрестном переходе или точечных перестройках в комплексах генов S, в отличие от вышеупомянутого примера, может быть исключена некоторыми наблюдаемыми особенностями этого явления.

Применение молекулярных маркеров

SNP и высокоплотные карты генетических связей томатов позволили создать целый ряд новых приложений. Преимуществом SNP-маркеров является возможность одновременного анализа тысяч маркеров в любой популяции, что позволяет картировать любой ген путем совместной сегрегации. В целом, можно придерживаться четырех стратегий картирования:

  1. картирование неравновесия связей;
  2. сегрегационный анализ межвидовых популяций;
  3. картирование QTL;
  4. селекция с помощью маркеров (MAS).

Картирование неравновесия связей

Картирование неравновесия связей (LD) (или геномное картирование ассоциаций) — это метод выявления связи без создания специальных сегрегационных популяций, а с использованием большого количества сортов. Целью является поиск ассоциаций между маркерами и признаками. Ван Берлоо и др. (2008) на основе маркеров рассчитали, что среднее окно вокруг интересующего гена у томата, где произошло не слишком много рекомбинаций, составляет 15 сантиморганов (сМ). Размер этого окна также определяется выбором материала. Когда рассматривались все культивируемые томаты, включая старинные и современные, Robbins et al. (2010) определили распад связи в 6-8 сМ. В современных сортах для переработки LD распадается на 6-14 cM, по сравнению с 3-16 cM в сортах для свежего рынка.

Сегрегационный анализ межвидовых популяций

Межвидовые сегрегационные популяции — которые получаются, например, при скрещивании восприимчивых линий с устойчивыми дикими сородичами — позволяют проводить генетические исследования и получать реальную оценку количества задействованных локусов. Анализ связей в таких популяциях часто выявляет совместную сегрегацию устойчивого фенотипа с присутствием определенных маркеров.

В настоящее время эти маркеры представляют собой SNPs с известным положением в последовательности томата. При наличии полностью аннотированной последовательности (где для всех последовательностей генов добавлена наиболее вероятная функция) (Tomato Genome Consortium, 2012) можно найти все гены с их предполагаемыми функциями в регионе, ограниченном сцепленными маркерами. Размер исследуемого фрагмента зависит от соотношения расстояний между генетической картой сцепления и физической картой. Горячие и холодные точки рекомбинации могут привести к большим различиям между генетической и физической картами (Viquez-Zamora et al., 2013). При необходимости для точного картирования любимого гена проводится скрининг большего количества маркеров в интересующем регионе и большего количества растений-потомков. Пример такого подхода приводится в работе Firdaus et al. (2012), в которой был помечен основной ген устойчивости к белокрылке, происходящий от S. galapagense.

Генетическая карта (cM)
Генетическая карта (cM)
Физическая карта (Mb)

Рис. Сравнение генетической или карты сцепления (сМ, сантиморганы) с физической картой (Мб, пары мегабаз) хромосомы 8 для популяции F2 между двумя томатами типа черри (57639132-8 обозначает позицию 57,6 млн bp на хромосоме 8).

Картирование QTL

Несколько иной подход необходим, когда интерес представляет «полевая» или количественная устойчивость. Необходима сегрегационная популяция, в которой определены полиморфизмы маркеров и где все отдельные растения фенотипированы (количественные признаки). Корреляции между генотипами маркеров и фенотипами могут быть рассчитаны вдоль карты сцепления. Таким образом, для каждого положения на геноме определяется вероятность присутствия QTL. При обнаружении значительных корреляций назначаются доверительные интервалы для QTL, влияющих на интересующий признак. Надежное и воспроизводимое фенотипирование является наиболее важным фактором в картировании QTL. Для проведения такого надежного теста часто необходимо большее количество повторов с генетически идентичными растениями. Для популяций F2 и BC1 это означает, что растения должны быть размножены либо черенками, либо размножением in vitro. RILs и ILs являются гомозиготными, и многочисленные семена, собранные на этих растениях, все генетически идентичны родительскому растению. Это позволяет проводить повторные скрининги во времени и пространстве, что ведет к более точному картированию QTL и получению знаний о взаимодействии генотип-среда (GxE).

Знания о положении этих QTL могут быть использованы в селекции с помощью маркеров (MAS) и могут служить отправной точкой для процедур геномной прогулки и клонирования генов. В настоящее время у томата выявлено и картировано множество QTLs для таких признаков, как устойчивость к холоду и соли, содержание растворимых веществ и других признаков, влияющих на качество плодов, а также для генов устойчивости к вредителям и патогенам (например, Fridman et al., 2004; Firdaus et al., 2012; Van Heusden et al., 1999).

Селекция с помощью маркеров (MAS)

После идентификации маркеров, связанных с интересующими признаками, и QTL, объясняющих достаточную часть вариации, признаки могут быть интрогрессированы в томат с использованием этих маркеров, вместо отбора по самому признаку. Это может повысить эффективность селекции, особенно если речь идет о труднооцениваемых признаках. MAS можно проводить уже на стадии рассады, что сокращает площадь теплиц, необходимых для селекционной программы. Селекция по дизайну — это метод объединения многих благоприятных признаков в одном генотипе (Peleman and Rouppe van der Voort, 2003).

Клонирование на основе карты

Карта сцепления высокой плотности также позволяет изолировать отдельные гены с помощью хромосомной прогулки или посадки хромосом. Хорошим примером является выделение гена, обеспечивающего позиционную стерильность у томата (Gorguet et al., 2009). После определения приблизительного расположения локуса в межвидовом скрещивании S. lycopersicum и S. pimpinellifolium, эксперимент по тонкому картированию указал только на один ген, а именно на полигалактуроназу дегисценции томата. Только одно нуклеотидное различие было ответственно за нераскрытие пыльников у мутанта. Этот подход становится все более и более осуществимым благодаря секвенированию следующего поколения и доступности полных аннотированных последовательностей геномов. К настоящему времени клонировано множество генов, которые вовлечены в количественные характеристики, такие как размер плода, вкус и урожайность.

Биохимическая и молекулярная генетика

Исследования этого типа на томате не развивались так быстро, как на других высших организмах. Это может быть связано с неспособностью обнаружить транспозируемые элементы в томате. Многие достоинства видов Lycopersicon для генетических исследований, включая передовой уровень картирования связей и базовую диплоидную природу L. esculentum, делают их привлекательными для таких исследований. Несколько исследовательских подразделений готовятся использовать томат в качестве среды для таких исследований; предположительно, по мере создания почвы, такие исследования будут продвигаться быстрее.

Хотя в 1975-1985 гг. аллозимам уделялось большое внимание, их соответствующие гены исследовались в основном как генетические маркеры для изучения сцепления, динамики популяций и других целей, отличных от молекулярной генетики в истинном смысле слова.
Молекулярные аспекты, однако, не были полностью проигнорированы, так как ферменты алкогольдегидрогеназы ADH-1 и ADH-2 были очищены и охарактеризованы в отношении их молекулярного веса Bicsak и др. (1982) и Tanksley и Jones (неопубликованное).

Исследования генетики белковой фракции 1 показали, что большая субъединица неизменна во всем роде (Gatenby and Cocking, 1978; Uchimiya* Chen and Wildman, 1979a). Те же работники сообщают о вариациях в малой субъединице, но только в кратных количествах одной и той же основной единицы у большинства видов. Это повторение приписывается какому-то типу полиплоидии, но поскольку подавляющее число цитогенетических данных свидетельствует в пользу диплоидной природы томата (Rick, 1971a), более вероятным кажется какой-то тип внутренней дупликации — возможно, тандемные повторы. В межвидовых гибридах между родителями, различающимися по числу кратных повторов, различия наследуются моногенно (Uchimiya, Chen and Wildman, 1979b).

Предварительные исследования природы хлоропластной ДНК были проведены Палмером и Замиром (1982). Хотя это исследование было основано на выборке всего 13 растений, представляющих род, оно показало крайне консервативную ситуацию, когда в пределах видов с цветными плодами не было обнаружено никаких различий. Исследование подтвердило отнесениеpennellii к Lycopersicon (D’Arcy, 1982), а не к Solanum, в котором он был классифицирован ранее, и указало на близкую принадлежность L. chilense и L. chmielewskii к L. peruvianum. Образцы последнего оказались полиморфными, что соответствует ранее обнаруженной (Rick, 1963) высокой полиморфности этого вида.

Генетика развития и физиологическая генетика

Исследования в этой общей области были весьма разнообразны. Использование определенных мутантов значительно ускорило исследования природы минерального дефицита, гормонального контроля поведения устьиц, развития цветка, созревания плодов и партенокарпии. В то время как большинство из этих тем представляют собой продолжение ранее начатых исследований, исследование генетически контролируемой партенокарпии является новой и многообещающей темой.

Исследования мутантов с избыточным увяданием продолжают давать больше информации о природе этих дефектов и в целом по теме экономии воды в растениях. Предыдущие исследования показали, что применение абсцизовой кислоты (ABA) компенсировало фенотипические дефекты flc, восстанавливая нормальный контроль открытия устьиц. Степень нормализации была более подробно изучена Пури и Таем (1977). В обработанных ABA растениях flc РНК-аза снизилась до нормального уровня, в то время как РНК, белок, соотношение растворимой и рибосомальной РНК и содержание воды увеличились до нормального уровня. Высокая влажность, как правило, вызывала те же изменения в flc, но восстановление не было полным. В дальнейшем исследовании (Tai et al., 1979) необработанные + и flc и обработанные ABA flc сравнивались по морфологическому фенотипу и уровням выделения этилена, триптофана, аминотрансферазы и декарбоксилирования [1-14C]индолуксусной кислоты. Обработка flc ABA вернула все эти признаки к нормальным (+) уровням, за исключением последнего, который был схож у + и необработанного flc, но выше у обработанного flc. В свете этих результатов была сформулирована гипотетическая эпигенетическая последовательность действия генов в/Zc, в которой снижение синтеза ABA представляется как основной эффект генов.

Еще одна глава в этой саге была написана Тейлором и Тарром (1984) о сравнительных эффектах flc, sit и not сами по себе и в трех возможных комбинациях двойных мутантных гомозигот. Во всех комбинациях фенотип был более экстремальным, чем у любой из родительских мутантных гомозигот, но тяжесть экспрессии в двойных комбинациях не могла быть предсказана на основе одиночных. То, что sit-flc был наименее изменен, позволяет предположить, что эти гены действуют сходным образом. Хотя это исследование не решило проблему действия генов, оно предполагает несколько возможных путей. Сильное ослабление в двойных комбинациях not-flc и not-sit предполагает, что только мутанты с недостатком ABA, подобные этой тройке, могут выжить; мутанты с полным недостатком ABA предположительно нежизнеспособны.

За одним примечательным исключением, мутации, влияющие на минеральное питание, в последнее десятилетие игнорировались. Исследование Epstein (1979) мутанта, дефектного в метаболизме калия, представляет особый интерес по нескольким причинам. Во-первых, программа индукции мутаций и скрининга была специально спланирована для получения K-дефектных мутантов. Во-вторых, исследование мутанта выявило тонкие метаболические отношения, которые отражаются на обоснованности стандартных анализов питания. Мутант является K-недостаточным в том смысле, что для его нормализации требуется корневая подкормка с концентрацией K в 100-200 раз больше, чем достаточно для + генотипов. Нормальный уровень K в растениях мутанта, испытывающих K-стард, доказывает, что нарушение не вызвано неспособностью поглощать или транслоцировать K, и показывает ошибочность использования листового анализа в качестве метода оценки минерального дефицита. Третий урок этого исследования заключается в том, что может быть трудно сделать обобщение на основе тестов одного генотипа.

Примеры вызванного температурой и гибберелловой кислотой возврата к фертильности у некоторых стерильных мутантов будут рассмотрены позже в связи с селекцией томатов. Генетически контролируемая партенокарпия также рассматривается позже в связи с качеством плодов.

Межвидовая и межродовая гибридизация

Отношения между видами Lycopersicon были предметом исключительного количества исследований. Такие исследования ускоряются рядом факторов, включая:

  1. стимулирование практических целей в улучшении томатов;
  2. легкость манипуляций с цветками для гибридизации;
  3. передовой статус генетики L. esculentum;
  4. благоприятная цитология, особенно пахитена в мейозе.
Скрещивание томата
Обобщение отношений скрещивания между репрезентативными вариантами видов Lycopersicon. Сплошные соединительные линии обозначают совместимые скрещивания, ширина линий указывает на степень скрещиваемости. Пунктирные линии обозначают неудачные скрещивания; пунктирные линии - комбинации, дающие потомство F1 только через культуру эмбрионов. Более крупные круги охватывают полностью скрещиваемые сорта. Отношения скрещиваемости родственных видов L. chmielewskii и L. parviflorum аналогичны, за исключением того, что первый не гибридизирует с L. hirsutum и L. pennellii.

Статус отношений скрещиваемости у Lycopersicon и родственных видов Solanum был обновлен Риком (1979). Обобщение этого исследования (рис.) показывает, что основной барьер отделяет L. chilense и L. peruvianum от остального рода. В пределах любой из этих двух основных подродовых групп большинство скрещиваний происходит без особых трудностей, хотя часто только в одном направлении. Напротив, гибридизация между этими двумя группами приводит к раннему разрушению эмбрионов, что, однако, можно обойти с помощью культуры эмбрионов и других методов. Таким образом, хотя иногда и ценой больших усилий, можно успешно скрещивать все виды во всех возможных комбинациях. Тот факт, что вся зародышевая плазма рода таким образом доступна для L. esculentum, значительно ускоряет фундаментальные и прикладные исследования.

Изучение таких гибридизаций, мейоза и фертильности последующих гибридов и их потомков, а также другие биосистемные данные привели к признанию девяти видов Lycopersicon (Rick, 1979). Таким образом, ранее описанные виды (L. glandulosum, L. ‘minutum’ и S. pennellii) получили соответствующий статус. L. glandulosum оказался лишь одной из тридцати или более рас L. peruvianum’, комплекс «minutum» состоит из двух родственных видов — L. parviflorum и L. chmielewskii’, а S. pennellii, поскольку во всех биосистемных отношениях он ведет себя как вид Lycopersicon, был переклассифицирован как вид этого рода (D’Arcy, 1982).

Что касается настоящих видов Solanum spp. с наиболее сильным родством с Lycopersicon, были получены гибриды F1 между L. esculentum и S. lycopersicoides, но их чрезвычайная стерильность, несмотря на получение умеренно фертильных аллоплоидов, препятствует дальнейшему прогрессу. Ни один другой член этого комплекса Lycopersicon-hke не поддался половой гибридизации с видами томатов. Но слияние протопластов открыло путь к еще более широкому скрещиванию, как показали Мелчерс, Сакристан и Холдер (1978) своим успехом в получении F1 гибридов между L. esculentum и Solanum tuberosum. Судьба этих и других соматических гибридов одного родительского вида была обобщена Мелчерсом (1984). Были обнаружены различные числа хромосом, хотя многие гибриды обладают ожидаемыми числами. Рост, похожий на «ведьмину метлу», препятствовал цветению многих гибридов, но даже цветущие гибриды с нормальным характером роста оказались абсолютно стерильными как при самоопылении, так и при обратном скрещивании с одним из родителей. Несмотря на эти неутешительные результаты, перспективы использования томатно-картофельных гибридов в селекционных целях пока рано списывать со счетов. Их потенциал не будет полностью реализован, пока не будет протестирован более широкий ассортимент родительских генотипов; кроме того, по мере развития новых методов переноса ДНК, введения хромосом и контролируемого удаления хромосом сохраняется надежда, что эти жесткие барьеры будут обойдены.

Что касается успешных скрещиваний, то многое удалось узнать о природе межвидовых различий у Lycopersicon. Полная пара хромосом в мейозе всех исследованных гибридов F2 показывает не только одинаковое гаплоидное число (12) у каждого вида, но и поразительную степень гомосексуальности. Нарушения наблюдаются лишь с низкой частотой, и они ограничены перицентрическими областями (Khush and Rick, 1963). Однако идеальное или почти идеальное спаривание не приводит к высокой плодовитости; напротив, многие гибриды чреваты генетической стерильностью, приводящей к пре- и постсингамовым абортам, и другими причинами неплодовитости, которые могут сохраняться в течение многих поколений. Помимо гибридной стерильности, встречаются и другие генетические нарушения. Так, при широком скрещивании L. esculentum X L. pennellii страдают как сегрегация, так и рекомбинация. Что касается первого, то большинство коэффициентов сегрегации отклоняются от нормы, обычно отдавая предпочтение аллелям рекуррентного родителя при беккроссе. Рекомбинация имеет тенденцию к снижению ниже контрольных уровней esculentum, эффект более выражен вблизи центромеры и снижается до нормального уровня в дистальном направлении. Модификация рекомбинации становится более интенсивной по мере замещения чужеродных хромосом в последующих поколениях (Rick, 1969, 1971b).

Генетическая изменчивость внутри каждого из видов Lycopersicon также изучалась в течение последнего десятилетия. Основным стимулом для этой работы стало расширение экспериментальных горизонтов, обеспечиваемое аллозимной изменчивостью. Ранее приходилось полагаться на грубые морфологические различия, почти все из которых наследуются количественно и подвержены высокой экологической дисперсии, и, следовательно, трудно провести различие между генетическими и экологическими эффектами. Другим фактором, благоприятствующим этим исследованиям, было наличие большого количества живого материала из природных популяций. Объем не позволяет подробно изложить анализ каждого вида; вместо этого приводится резюме, взятое из обзорной статьи Рика (1984b).
Характер аллозимной изменчивости в значительной степени зависит от систем спаривания, которые у этих видов весьма разнообразны. В одной крайности находятся строго автогамные виды L. cheesmanii, L. parviflorum и периферийные популяции L. pimpinellifolium. Дисперсия внутри популяций этих таксонов практически равна нулю, в то время как межпопуляционные значения велики. На противоположном полюсе находятся строго SI — следовательно, аллогамы — виды L. chilense, pennellii и peruvianum, у которых общая изменчивость значительно больше, а внутрипопуляционная доля общей изменчивости значительно больше межпопуляционной. Промежуточное положение занимают факультативные виды L. chmielewskii, hirsutum, pimpinellifolium и дикие формы L. esculentum. У всех этих видов, кроме L. hirsutum, растения самосовместимы (SC), но подвержены различному количеству ауткроссингов; L. hirsutum состоит как из SC, так и SI рас. L. chmielewskii — редкий эндемик, ограниченный небольшой территорией в центральных Перуанских Андах; остальные виды гораздо шире распространены в прибрежных районах Эквадора и Перу. В последней группе существует поразительный контраст между центральными, сильно изменчивыми элементами и периферийными, очень однородными, даже автогамными формами. Популяции с промежуточной изменчивостью встречаются на промежуточной территории. Полученная таким образом информация служит руководством для поддержания и использования популяций диких томатов. Более 800 образцов, на которых были основаны эти исследования, поддерживаются и распространяются Фондовым центром генетики томата.

Биотехнологии и трансгенные или генетически модифицированные организмы (ГМО)

С 1970-х годов в томате были разработаны технологии регенерации растений из тканей или отдельных клеток, введения генов путем трансформации или разрушения границ между несочетаемыми видами путем соматической гибридизации. Потенциал для селекции очевиден. Благодаря биотехнологии генетическая вариативность, пригодная для использования в селекции томатов, возросла почти до неограниченного уровня. Фактически, томат стал первой продовольственной культурой, для которой были коммерчески доступны трансгенные плоды.

Первый трансгенный сорт ‘Flavr-Savr’TM’ был выпущен в 1994 году, вскоре за ним последовал трансгенный продукт с более длительным сроком хранения (Murray et al., 1995). После первых восторженных откликов «Flavr-Savr» в конечном итоге не стал коммерчески успешным. Это было связано с другими неблагоприятными признаками трансгенного сорта. В то время не существовало таких препятствий, как непринятие обществом трансгенных продуктов питания. Однако в конце прошлого века это отношение изменилось, и сейчас на рынке нет трансгенных продуктов из томатов.

Как было сказано выше, компании по разведению томатов инвестировали в биотехнологии, но не выпускают трансгенные сорта на рынок. Причинами этого являются сложное и дорогое оформление патента, связанное с трансгенными культурами, отсутствие общественного признания и богатство имеющихся генетических вариаций для достижения тех же целей без трансгенных культур.

В 2016 году глобальная площадь трансгенных культур достигла 185 миллионов гектаров, а накопленная площадь (посаженная с 1996 года) достигла 2,1 миллиарда гектаров (ISAAA, 2016). Поскольку это не привело ни к каким прямым жертвам, можно ожидать, что общественное признание постепенно изменится.

Литература

Tomatoes, 2nd Ed. by Ep Heuvelink. Wageningen University & Research. The Netherlands. 2018.

The Tomato Crop. A scientific basis for improvement. E.H. Roberts. USA. 1986. 

×
Русфонд