Fijación de nitrógeno

Importancia de la fijación de nitrógeno

El nitrógeno representa el 78,09% del aire atmosférico. Sobre 1 hectárea de tierra o superficie de agua de la Tierra hay alrededor de 80 mil t de nitrógeno, que es inaccesible para la mayoría de las plantas superiores.

En condiciones naturales, cuando el nivel de nitrógeno mineral en el suelo es bajo, las leguminosas son especialmente exitosas gracias a su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. Varias otras plantas que poseen esta característica, por ejemplo especies de gunnera (Gunnera), aliso (Alnus) y casuarina (Casuarina), tienen relaciones simbióticas con organismos del suelo que colonizan sus raíces. La simbiosis de plantas y organismos beneficiosos, como muestran los datos fósiles, fue uno de los principales factores del éxito de la dispersión de las plantas. Aunque los genes necesarios para la señalización del inicio de la colonización de las raíces han sido caracterizados, el origen de estos genes sigue sin esclarecerse (Delaux et al., 2015).

Dependiendo de las fuentes de energía, los microorganismos fijadores de nitrógeno se clasifican en: autótrofos y heterótrofos.

Según las estimaciones, el volumen total anual de fijación de nitrógeno en los ecosistemas terrestres es de 175-190 millones de t de nitrógeno, de los cuales 90-110 millones de t corresponden a suelos de tierras agrícolas (Mishustin, 1983). Al mismo tiempo, la extracción anual de nitrógeno del suelo con productos agrícolas es de 110 millones de t. Según otras estimaciones, en el mundo se fijan anualmente 50-140 millones de toneladas de nitrógeno mediante la fijación de nitrógeno (Unkovich et al., 2008). En 2009, en la UE se fijaron alrededor de 0,8 millones de toneladas de nitrógeno (Baddeley et al. (2013)).

Las leguminosas tienen relaciones específicas con bacterias del suelo del género Rhizobium, en las que las bacterias penetran en las raíces, lo que conduce al proceso de conversión del nitrógeno atmosférico en soluble. La capacidad de simbiosis con Rhizobium es una de las principales razones por las que las leguminosas se caracterizan como «plantas pioneras», ya que normalmente colonizan suelos con bajo contenido de nitrógeno y a menudo en ambientes abiertos (Cloutier et al., 1996). Los cultivos capaces de formar relaciones simbióticas son una de las principales fuentes de nitrógeno en sistemas agrícolas con recursos limitados.

Después de la cosecha, cuando la mayor parte del nitrógeno fijado en forma de proteína se elimina del campo, queda un nivel residual de nitrógeno en el rastrojo, el sistema radicular y los nódulos. Donde las raíces permanecen para descomponerse en el suelo, el nitrato se libera lentamente y está disponible para su absorción por el siguiente cultivo. Estos niveles pueden variar significativamente, pero se reconoce que constituyen alrededor de 20-50 kg N/ha (Sylvester-Bradley and Cross, 1991; Ward and Palmer, 2013). Para habas forrajeras, las estimaciones realizadas en el Reino Unido suponen una fijación de 60-100 kg N/ha en residuos de tallos y raíces después de la cosecha (Iannetta et al., 2015).

Esta fuente de nitrógeno es económicamente valiosa en el sistema de cultivo, ya que proporciona una fuente de nitrógeno inmediatamente para el siguiente cultivo. Dado que el nitrógeno fijado se libera en el suelo relativamente despacio, el riesgo de lixiviación en períodos húmedos es menor que con la aplicación de fertilizantes, pero, no menos importante, el nitrógeno residual disponible para el siguiente cultivo reduce su necesidad en aproximadamente 50 kg/ha. Además, la inclusión de un cultivo de leguminosas en la rotación proporciona una «pausa» en un sistema basado predominantemente en cereales, reduciendo la acumulación de patógenos de cereales, como el hongo Gaeumannomyces graminis, y brindando la oportunidad de controlar malezas perennes y gramíneas como el alpiste cimarrón Alopecurus myosuroides, que ha desarrollado resistencia a los graminicidas de uso común. En la UE se calculó que el rendimiento de trigo de invierno inmediatamente después de un cultivo de leguminosas aumenta en 0,6 y 0,9 t/ha (Von Richtofen, 2006), y se ha observado una respuesta similar en Canadá (Wright, 1990). En algunos estudios con habas forrajeras (Vicia faba), su inclusión en la rotación aumenta la diversidad de flora y fauna silvestres, así como de la microflora del suelo (Kopke and Nemecek, 2010). Por lo tanto, existen pruebas convincentes a favor de la rotación de cultivos en campo apoyada por la inclusión de un cultivo de leguminosas (Iannetta et al., 2013).

Intensidad de la fijación de nitrógeno

El proceso de fijación de nitrógeno es realizado por bacterias anaerobias de vida libre en el suelo Clostridium pasteurianum, aerobias Azotobacter chroococcum y bacterias nodulares que viven en simbiosis en el sistema radicular de las leguminosas, Rhizobium. Su actividad y la eficacia de la fijación de nitrógeno están influidas por el suministro de carbohidratos, fósforo, calcio y otros elementos, la reacción del medio edáfico, la temperatura y la humedad.

La eficacia está influida por el estado nitrogenado del suelo. Esto es especialmente evidente cuando el nivel de nitrógeno inorgánico en el suelo es alto y suprime la formación natural de nódulos y la fijación de nitrógeno (Slattery et al., 2004). Un experimento realizado por B. A. Yagodin junto con Yu. Ya. Mazel y Yu. G. Sazonov en 1981 mostró la dependencia de la fijación simbiótica de nitrógeno del suministro de nitrógeno a las plantas y de la intensidad de la fotosíntesis. En este experimento, el lupino de la variedad Bystrorastushchiy 4 se cultivó con diferentes niveles de suministro de nitrógeno y con sombreado de 1, 3 y 6 días. La iluminación varió 1000 veces. El sombreado provocó una disminución de la fijación de nitrógeno, en mayor medida con alto contenido de nitrógeno mineral. Después de 6 días de sombreado, la fijación de nitrógeno en la variante sin nitrógeno disminuyó 40 veces, en la variante con dosis mitad se detuvo por completo, y con dosis dobles la fijación de nitrógeno se detuvo ya después de 3 días de sombreado. El máximo de intensidad de fijación de nitrógeno se observó en la fase de floración en las variantes sin nitrógeno y con dosis mitad. En la fase de botón floral, con dosis mitad fue mayor que en la variante sin nitrógeno. Esto se explica porque una pequeña dosis inicial de nitrógeno favorece un mejor desarrollo de los nódulos en las primeras etapas de desarrollo. En la fase de floración, en la variante sin nitrógeno este indicador fue mayor que en las variantes con nitrógeno. En la fase de botón floral, el máximo de fijación de nitrógeno en el ciclo diario correspondió a las horas de la mañana (8 h), y en la variante con dosis mitad la fijación transcurrió más rápido que en la variante sin nitrógeno. En la fase de floración, el máximo correspondió al mediodía. En este caso fue mayor en la variante sin nitrógeno. Con dosis elevada de nitrógeno, este indicador disminuyó en todas las fases de desarrollo. Un flujo más intenso de productos marcados con ¹⁴C se observó en la variante sin nitrógeno. Con dosis doble fue un 20% menor. 30 min después de la exposición, la marca se detectó en los nódulos de ambas variantes (0,37 y 0,07 respectivamente, de la actividad total). Durante 2,5 h, en la variante sin nitrógeno entraron en los nódulos 7 veces más productos que en la variante con nitrógeno, en las raíces 5 veces más, y en los tallos 2 veces más. La velocidad desigual de entrada de productos de la fotosíntesis en los nódulos radiculares con diferentes niveles de nutrición nitrogenada influyó en la intensidad de la fijación de nitrógeno. Debido a la acumulación de productos de la fotosíntesis en la variante con nitrógeno, el sombreado durante 3 días suprimió la fijación de nitrógeno de los nódulos. Así, el sombreado de lupino conduce a una reducción de la fijación de nitrógeno, pero en la variante con fondo de nitrógeno mineral esta reducción es mayor que sin nitrógeno.

El coeficiente de fijación de nitrógeno es de 0,3 a 0,85.

La intensidad de la fijación de nitrógeno por bacterias de vida libre depende de las reservas de sustancias orgánicas fácilmente disponibles que sirven como fuente de energía. Por ejemplo, la actividad de fijación de nitrógeno en la zona radicular de las plantas debido a la fijación asociativa de nitrógeno es 3-200 veces mayor que en los suelos entre hileras. Por eso las plantas son el principal factor de la actividad de las bacterias diazótrofas en la rizosfera gracias a la exudación radicular y la caída de raíces, cuyo volumen es del 25 al 50% de la producción fotosintética.

La intensidad de la fijación de nitrógeno de los diazótrofos está determinada por la actividad excretora de los sistemas radiculares de las plantas, es decir, en última instancia, por la actividad fotosintética. La alta actividad en la rizosfera de muchas plantas tropicales está relacionada con la capacidad de utilizar la vía de los ácidos C-4-dicarboxílicos en la fotosíntesis. Las plantas de este tipo requieren iluminación intensa, y su velocidad máxima de fotosíntesis es considerablemente mayor que la de las plantas que utilizan el ciclo de Calvin (tipo C-3). Como las plantas con tipo C-4 consumen menos carbohidratos en la fotorrespiración, parte de ellos se utiliza para el crecimiento de las raíces y la exudación radicular.

La fijación no simbiótica de nitrógeno ha sido estudiada por muchos investigadores, pero la información sobre su escala en diferentes zonas edafoclimáticas es escasa, debido a que en condiciones naturales este proceso depende de una serie de factores ambientales dinámicos. Así, según varios estudios de suelos fértiles de arrozales, como resultado de la fijación no simbiótica bajo el arroz pueden acumularse 60-70 kg/ha de nitrógeno al año. Además, en suelos inundados se fijan 57-63 kg/ha de nitrógeno, y en no inundados, 3-7 kg/ha; sin plantas en suelos inundados, 23-28 kg/ha de nitrógeno.

Durante 3 meses de vegetación, la fijación de nitrógeno en los suelos de arrozales del krai de Krasnodar fue de 9-27 kg. La incorporación de paja al suelo favorece la reproducción de diversos grupos de bacterias fijadoras de nitrógeno y el aumento de la fijación de nitrógeno hasta 20-40 kg/ha al mes. La humedad también favorece el aumento de la actividad durante la descomposición de paja y celulosa. En suelos intrazonales de humedad excesiva, es decir, suelos de llanura aluvial, pantanosos y plantaciones de arroz, la actividad es más alta: de 16,5 a 67,5 kg/ha al mes. En suelos de la zona tropical, la fijación no simbiótica de nitrógeno promedia 200 kg/ha al año, alcanzando a veces 600 kg/ha al año.

La actividad de la fijación no simbiótica de nitrógeno también depende de: humedad, temperatura, composición granulométrica del suelo, grado de aireación de la capa habitada por las raíces, contenido de dióxido de carbono, presencia de macro- y microelementos. Los fertilizantes minerales, el encalado y el régimen de aire también influyen en la intensidad, pero se observa una alta eficacia cuando la humedad, la temperatura y la materia orgánica no limitan la fijación de nitrógeno. La incorporación de residuos vegetales en suelos césped-podzólicos permite aumentar la actividad fijadora de nitrógeno en 2-5 veces, siempre que haya suficiente humedad.

La temperatura influye en la velocidad de fijación de nitrógeno, y las temperaturas extremadamente altas o bajas reducen la eficacia. La fijación de nitrógeno en las leguminosas es sensible al exceso de agua (James and Crawford, 1998), a la sequía y al nivel de salinidad del suelo combinado con un alto pH. La deficiencia de minerales clave también puede limitar la fijación de nitrógeno, especialmente de fósforo. En especies de alfalfa (Medicago spp.) el tamaño y el peso de los nódulos disminuyeron con deficiencia de P (Schultze and Drevon, 2005).

Los fertilizantes nitrogenados minerales ejercen una acción reguladora sobre la fijación de nitrógeno. En experimentos in vitro se demostró la inhibición de la fijación de nitrógeno en presencia de nitrógeno combinado (en ausencia de plantas). La inhibición se observa con dosis de nitrógeno combinado superiores a 500-1000 kg/ha. Las dosis de fertilizantes utilizadas en la agricultura causan una supresión temporal de la fijación de nitrógeno. Al mismo tiempo, los fertilizantes nitrogenados estimulan el desarrollo de las plantas, aumentan la productividad de la fotosíntesis y aumentan la escala de exudación, favoreciendo así la fijación asociativa de nitrógeno en las etapas posteriores del desarrollo de la planta, cuando el exceso de nitrógeno mineral de los fertilizantes en el suelo disminuye considerablemente.

El uso del método radiométrico en estudios de la cantidad de materia orgánica en residuos de cosecha y raíces permitió revelar que, debido a las exudaciones radiculares durante la vegetación y la muerte constante de parte del sistema radicular después de la cosecha, en el suelo queda 3-4 veces más materia orgánica que al determinar este indicador por métodos convencionales. Al calcular la materia orgánica también deben tenerse en cuenta los órganos aéreos de las plantas que mueren durante su vida.

En simbiosis con bacterias nodulares, los cultivos de leguminosas son capaces de satisfacer hasta el 60-90% de su necesidad de nitrógeno. Los cultivos de leguminosas de grano anuales, por ejemplo el lupino, guisante, fijan por temporada 50-100 kg/ha de nitrógeno, la mitad del cual permanece en el suelo; las leguminosas forrajeras perennes (trébol, alfalfa) — 180-300 kg/ha, de los cuales con raíces y residuos de cosecha quedan en el suelo 70-100 kg/ha.

Bacterias fijadoras de nitrógeno

Los fijadores autótrofos de nitrógeno son cianobacterias y bacterias anaerobias fotosintéticas. Tienen importancia solo en condiciones de exceso de humedad y en suelos inundados, donde la fijación alcanza 20-50 kg/ha de nitrógeno al año.

Las bacterias heterótrofas fijadoras de nitrógeno están distribuidas en todos los tipos de suelos en la rizosfera y la filósfera de las plantas. De este grupo están bien estudiadas las bacterias nodulares y su papel en la nutrición nitrogenada de las leguminosas y el enriquecimiento del suelo con nitrógeno. La contribución de otros fijadores simbióticos heterótrofos, por ejemplo los endosimbiontes del aliso y del espino amarillo, aún está poco estudiada.

Las bacterias heterótrofas fijadoras de nitrógeno no simbióticas también están poco estudiadas, aunque la capacidad fijadora de nitrógeno de los microorganismos se descubrió precisamente en representantes de este grupo. En suelos de la zona de clima templado fijan hasta 3-5 kg/ha de nitrógeno al año. Se ha revelado una gran diversidad de especies y su amplia distribución en suelos de todas las zonas climáticas, en la rizosfera y en la superficie de las plantas, en cuerpos de agua, limos y sedimentos, en el intestino de insectos, peces y animales superiores.

La capacidad de fijar nitrógeno se ha encontrado en un gran número de bacterias de diversos grupos sistemáticos. Además de Azotobacter, Clostridium y las bacterias nodulares, también poseen esta capacidad bacterias: Arthrobacter, Bacillus, Erwinia, Klebsiella, etc. Los cultivos puros de microorganismos eucariotas, incluidos hongos y levaduras, no poseen actividad fijadora de nitrógeno; sin embargo, los cultivos mixtos de fijadores de nitrógeno con eucariotas se distinguen por una mayor actividad nitrogenasa. Las bacterias del grupo Azotobacter se desarrollan bien en suelos aireados cultivados, bien caldeados y neutros, que contienen fósforo y calcio. En condiciones favorables acumulan hasta 30 kg de nitrógeno por 1 ha.

La actividad activa de las bacterias nodulares se determina por el color rosado o rojo de los nódulos; con poca actividad, los nódulos tienen color blanco o verde pálido. Para activar su actividad, las semillas de cultivos de leguminosas de grano se tratan con fertilizantes bacterianos, por ejemplo rizotorfin o nitragina.

Las bacterias nodulares son bastoncillos; en estado libre son aerobios estrictos y no son capaces de asimilar el nitrógeno del aire. Se han establecido varias especies de bacterias nodulares, que se diferencian por el tipo de relación con la planta hospedadora. Algunas especies de bacterias son capaces de infectar a un grupo de plantas leguminosas, otras son muy específicas y entran en simbiosis solo con cultivos determinados.

Rizobios (Rhizobium)

No todas las especies de leguminosas tienen relación con la misma cepa o especie de bacterias rizobias del suelo (Rhizobium). Los organismos Rhizobium son de vida libre y móviles en el suelo y, como tales, no son capaces de fijar nitrógeno atmosférico. La formación de nódulos no ocurrirá si la especie correspondiente no está presente en el suelo. Dentro de cada especie de Rhizobium existe una serie de cepas específicas para un hospedador concreto. Por lo general, las especies de arveja (Vicia spp.) y guisante (Pisum spp.) se asocian con Rhizobium leguminosarum, pero se considera que dentro de esta especie distintas cepas bacterianas prefieren cada especie de cultivo. Estudios recientes también han mostrado que existen dos clases genéticas diferentes de Rhizobium que infectan las habas forrajeras (Vicia faba) (Del Egido, 2014). La judía (Phaseolus vulgaris) está asociada con Rhizobium phaseoli; y las especies de lupino, como otro ejemplo, tienen relación con Bradyrhizobium lupini.

En muchos casos, la especie/subespecie de Rhizobium que infecta hospedadores específicos está presente en el suelo, pero en algunas situaciones, especialmente al cultivar cultivos no locales, las semillas pueden inocularse con preparados comerciales de cepas o especies específicas de Rhizobium para ese cultivo.

Especies de Rhizobium y su área de hospedadores (Smartt, 1976):

• Bradyrhizobium japonicum (sin. Rhizobium japonicum) — soja (Glycine sp.);
• Rhizobium leguminosarum — guisante (Pisum sp.), arveja (Vicia sp.), lenteja (Lens sp.), almorta (Lathyrus sp.);
• Bradyrhizobium lupini — lupino (Lupinus sp.);
• Ensifer meliloti (sin. Rhizobium meliloti) — meliloto (Melilotus sp.), alfalfa (Medicago sp.), fenogreco (Trigonella sp.);
• Rhizobium phaseoli — judía (Phaseolus sp.);
• Rhizobium leguminosarum (sin. Rhizobium trifolii) — trébol (Trifolium sp.).

La cantidad de nitrógeno fijado depende de muchos factores, como la eficacia de la cepa de Rhizobium, el estado de la planta hospedadora, los factores físicos del ambiente y los métodos agronómicos. La cantidad de nitrógeno fijado varía considerablemente; según diversos datos, es de 45 kg a 550 kg N/ha para las habas forrajeras (Vicia faba) (Nutman, 1976) y se comparó para una serie de especies de cultivos de leguminosas en el trabajo de Salunkhe y Deshpande (1991).

Fijación relativa de nitrógeno por algunos cultivos de leguminosas (Salunkhe and Deshpande, 1991), en kg de nitrógeno por 1 ha al año:

• alfalfa — 114–223, según otros datos 250-300, a veces hasta 500;
• trébol — 21–36 (150-160, a veces hasta 250);
• garbanzo (de carnero) — 24–84;
• judía — 178–251;
• haba de jardín — 174–196;
• guisante — 87–222;
• lenteja — 167–189;
• lupino — 121–157 (160-170, a veces hasta 400);
• soja — 22–310.

Fijación asociativa de nitrógeno

Fijación asociativa de nitrógeno — fijación de nitrógeno en el fitoplano, es decir, la rizosfera y la filósfera de plantas no leguminosas. Por primera vez, la posibilidad de fijación de nitrógeno en la zona radicular de cultivos no leguminosas fue predicha en 1926 por S. P. Kostychev, y posteriormente confirmada experimentalmente por investigaciones con el método de balance (experimento de Broadbalk (Inglaterra), experimento de Pryanishnikov, experimento «centeno eterno» (Alemania)).

El cultivo continuo de cultivos no leguminosas no condujo a una disminución significativa del contenido de nitrógeno en el suelo, a pesar de su extracción anual con la cosecha; al mismo tiempo, en barbecho la cantidad de nitrógeno disminuía continuamente. En la fijación asociativa de nitrógeno, los microorganismos y las plantas no entablan una interacción como en los sistemas simbióticos; sin embargo, en general, tiene las mismas particularidades: la actividad de la fijación de nitrógeno cambia a medida que se desarrollan las plantas, alcanza el máximo en los períodos de botón floral y floración, y disminuye al madurar.

Inicialmente se prestó atención a la interacción de bacterias fijadoras de nitrógeno (Spirillum spp., Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense, etc.) con el sistema radicular de plantas gramíneas tropicales. Sin embargo, la afirmación sobre la unicidad de las propiedades de las azospirilas resultó exagerada. Actualmente se conoce la fijación de nitrógeno por la rizosfera del arroz, maíz, sorgo, trigo, algunas especies de gramíneas tropicales. Se conocen más de 200 especies de plantas no leguminosas capaces de fijar nitrógeno con ayuda de microorganismos rizosféricos.

La fijación asociativa de nitrógeno tiene gran importancia ecológica; precisamente gracias a ella se produce el reabastecimiento del fondo de nitrógeno disponible en la mayoría de los ecosistemas naturales. Sin embargo, las bacterias nodulares (Rhizobium) en simbiosis con cultivos de leguminosas muestran la mayor eficacia: en condiciones óptimas la fijación biológica de nitrógeno alcanza más de 300 kg/ha al año.

Mecanismo de la fijación biológica de nitrógeno

A finales del siglo pasado se formulaban diversas hipótesis sobre los mecanismos de fijación del nitrógeno. Se consideraban dos variantes: oxidativa y reductora. D. N. Pryanishnikov consideraba que la transición de N₂ a NH₃ a través de óxidos de nitrógeno era imposible, ya que contradice el principio de economía energética admisible de los organismos. S. N. Vinogradski a finales del siglo pasado expresó la suposición sobre un método de fijación reductora del nitrógeno molecular hasta amoníaco.

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.Esquema hipotético de la transformación del nitrógeno durante la fijación de nitrógeno

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El mecanismo del proceso de asimilación del nitrógeno se presenta en este caso como la acción del hidrógeno en el momento de su liberación sobre el nitrógeno gaseoso en el protoplasma vivo de la célula. La hipótesis de que la síntesis de amoníaco es el resultado directo de este proceso nos parece fundamentada.

S. N. Vinogradski Sobre la asimilación del nitrógeno gaseoso de la atmósfera por los microbios

P. A. Kostychev desarrolló la teoría de S. N. Vinogradski sobre la fijación reductora del nitrógeno molecular a través del amoníaco. Actualmente este mecanismo se considera universalmente aceptado.

Las bacterias nodulares (Rhizobiales) son estimuladas a infectar a través de los pelos radiculares o a través de grietas en la epidermis de las plantas hospedadoras por exudados radiculares que contienen flavonoides, los cuales se liberan al suelo durante el crecimiento de las raíces (Sprent and James, 2007). Los mecanismos genéticos que participan en el inicio de esta infección se están estudiando actualmente. Se ha demostrado que la presencia de calcio y la señalización asociada a él en los pelos radiculares es un factor importante en todo el proceso. Las bacterias rizobiales fijadoras de nitrógeno que se asocian con las leguminosas señalan a sus hospedadores el inicio de la simbiosis mediante la liberación de compuestos difusibles, incluidos los lipoquitooligosacáridos, también conocidos como factores Nod. Estos provocan oscilaciones de iones de calcio en las células epidérmicas de la raíz (Sun et al., 2015). Los elementos principales de esta señalización, que se están dilucidando en investigaciones actuales, se convertirán en la piedra angular para estudiar la posibilidad de crear asociaciones simbióticas similares con cultivos no leguminosas (Oldroyd and Dixon, 2014).

Una vez fijadas en las raíces, las bacterias se multiplican y se desplazan a la corteza de la raíz a través del hilo de infección, que es un tubo formado por paredes celulares. Las raíces responden a esta infección formando nódulos radiculares, que surgen como resultado del aumento de las células del tejido radicular. El desplazamiento de las bacterias dentro de las raíces conduce a la formación de nuevos nódulos, y a medida que los nódulos envejecen mueren, liberando rizobios al suelo para invadir nuevas raíces. Los nódulos proporcionan un nicho especializado que permite a los rizobios fijar nitrógeno en condiciones de cantidad mínima de aire, lo que protege a la enzima nitrogenasa, pero permite la presencia de suficiente oxígeno para la respiración aerobia asociada a la fijación de nitrógeno (Gallon, 1992; Minchin et al., 2008). El nódulo también permite a las bacterias simbióticas intercambiar eficazmente el nitrógeno fijado a cambio de carbohidratos de la planta hospedadora. El nitrógeno se convierte primero en amoníaco, utilizando la energía que procede del metabolismo de los carbohidratos (Emerich and Burris, 1978). Luego el amoníaco se convierte en aminoácidos, que las bacterias utilizan para producir proteínas y peptonas necesarias para su crecimiento. El nitrógeno fijado, incorporado en los rizobios, se libera luego en forma de aminoácidos, que son absorbidos por la planta hospedadora (White et al., 2007; Anderson et al., 2013).

La principal enzima responsable de la fijación de nitrógeno es la nitrogenasa. En los cultivos de leguminosas está concentrada en las bacterias nodulares. Las dificultades para aislar esta enzima de organismos celulares retrasaron durante mucho tiempo el estudio de los procesos bioquímicos de la fijación de nitrógeno. La nitrogenasa solo puede aislarse en ausencia de aire.

Por primera vez se obtuvieron extractos libres de células a partir de nódulos de soja en 1968 en el laboratorio de Evans. En la URSS se aisló por primera vez un complejo enzimático (nitrogenasa) a partir de bacteroides de nódulos de lupino y soja en 1970.

La nitrogenasa consta de dos estructuras proteicas: una, con masa molecular de 164 000, contiene molibdeno y hierro; la otra, con masa molecular de 56 000, contiene solo hierro. Por separado, estas estructuras no fijan nitrógeno molecular.

En la mayoría de los microorganismos, la nitrogenasa se inactiva por el oxígeno, y la proteína Fe es más sensible al oxígeno que la proteína Mo-Fe. La proteína Fe también es muy sensible al frío y se inactiva a una temperatura de 0 °C. Para la reacción bioquímica de reducción del nitrógeno es necesaria la presencia de ATP, una fuente de electrones e iones Mg²⁺. La mayoría de los científicos considera que para la fijación de 1 molécula de nitrógeno se consumen 15 moléculas de ATP.

Una característica distintiva de la nitrogenasa es la capacidad de reducir no solo el nitrógeno molecular, sino también otras moléculas con triple enlace. Esta característica permitió utilizar el método de determinación de la fijación de nitrógeno por la reducción de acetileno (HC≡CH) a etileno (H₂C=CH₂).

La bioquímica de la nitrogenasa no se ha estudiado por completo. Por ejemplo, no se sabe cómo se combina la energía de la hidrólisis del ATP con la transferencia de electrones, cómo transcurre la reducción de la molécula de nitrógeno, y no está claro el mecanismo de participación del hierro y el molibdeno en este proceso. La necesidad de molibdeno en el Azotobacter fijador de nitrógeno es mucho mayor que en las especies nitrato-reductoras.

En la fijación simbiótica de nitrógeno también participan otras enzimas que contienen metales, por ejemplo, la leghemoglobina, que se localiza en las células vegetales. En los nódulos está presente como producto de la simbiosis de bacterias y plantas superiores, pero la actividad de la fijación de nitrógeno depende de su concentración en los nódulos.

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.Esquema de la reducción escalonada del nitrógeno a través de diimida e hidracina durante la fijación de nitrógeno (Hardy, 1970)

image::stepwise-nitrogen-reduction-scheme.jpg[Esquema de la reducción escalonada del nitrógeno a través de diimida e hidracina durante la fijación de nitrógeno]

La nitrogenasa es muy sensible al oxígeno, pero los rizobios necesitan oxígeno para respirar. En los nódulos hay una alta concentración de leghemoglobina, que transporta oxígeno y rodea a las bacterias en los nódulos infectados. Esta leghemoglobina es capaz de transferir a las bacterias oxígeno en baja concentración, por lo que su presencia en los nódulos es necesaria. En condiciones anaerobias o en suelos pantanosos, la velocidad de fijación de nitrógeno disminuye mucho, y para una fijación biológica eficaz de nitrógeno se necesita un tipo de suelo bien aireado.

La función de la leghemoglobina es similar a la del hemoglobina y consiste en la unión reversible de oxígeno. La leghemoglobina es un transportador de oxígeno, no participa en la reducción del nitrógeno, pero participa en los procesos de formación de energía ATP, que transcurren con participación del oxígeno, y al mismo tiempo permite mantener condiciones anaerobias para el funcionamiento de la nitrogenasa. El mecanismo de protección de la nitrogenasa contra el oxígeno es complejo, y la leghemoglobina es, probablemente, solo uno de los eslabones de este proceso.

En los fijadores anaerobios de nitrógeno se supone que existen varios mecanismos de protección de la nitrogenasa contra el oxígeno. Por ejemplo, la muy alta actividad respiratoria del Azotobacter es un sistema de protección contra la inactivación por oxígeno.

Otro método supuesto es la «protección conformacional de la nitrogenasa», es decir, el cambio espacial del componente proteico de la nitrogenasa en presencia de oxígeno.

En la fijación de nitrógeno participan corrinoides, compuestos del grupo de la vitamina B₁₂, que incluyen cobalto. La necesidad de cobalto se demostró en experimentos de cultivo simbiótico de leguminosas en medios nutritivos carentes de nitrógeno, y se estableció por el hecho de una acción positiva sobre la actividad de la fijación de nitrógeno. En los nódulos, los corrinoides están presentes en las bacterias nodulares (bacteroides) y en el tejido vegetal del nódulo.

El papel bioquímico de la vitamina B₁₂ en la fijación de nitrógeno está poco estudiado; se sabe que los compuestos del grupo B₁₂ forman parte de las enzimas metilmalonil-CoA-mutasa y ribonucleótido reductasa.

Los derivados de la vitamina B₁₂ catalizan reacciones bioquímicas en las que se produce la transferencia de hidrógeno entre dos átomos de carbono adyacentes con el desplazamiento simultáneo de otros grupos en dirección opuesta.

Papel de las coenzimas cobamídicas en los nódulos de plantas leguminosas

Aplicación de la fijación de nitrógeno en la agricultura

Al resolver problemas prácticos relacionados con la nutrición nitrogenada, un lugar importante lo ocupa la proporción de nitrógeno biológico en el balance de nutrientes. Los datos sobre la magnitud de la fijación simbiótica de nitrógeno son diversos. Por ejemplo, según A. V. Sokolov, la cantidad de nitrógeno fijado por el trébol varía del 45 al 95%; según V. E. Shevchuk, solo un tercio del nitrógeno es fijado por las plantas leguminosas de la atmósfera; según E. N. Mishustin, al año en los residuos radiculares de la alfalfa se acumulan aproximadamente 100 kg/ha de nitrógeno y 50 kg/ha en el trébol.

Según los cálculos de N. S. Avdonin, basados en los datos de D. N. Pryanishnikov sobre la capacidad del trébol de fijar 150 kg/ha de nitrógeno al año, y de la alfalfa, 250-300 kg/ha, la magnitud de la asimilación simbiótica de nitrógeno molecular puede alcanzar 3 millones de t; según los cálculos de E. N. Mishustin, alrededor de 3,5 millones de t. A escala de la biosfera, el papel de la fijación simbiótica de nitrógeno es pequeño, ya que los cultivos de leguminosas representan alrededor del 10% de la superficie total sembrada de cultivos agrícolas, y en fitocenosis naturales son mucho menos.

En condiciones favorables de simbiosis, es decir, con pH_sal 6-7, suministro de fósforo, potasio, magnesio, boro, molibdeno, presencia de cepas virulentas específicas de bacterias nodulares y humedad óptima del suelo, el guisante de jardín fija hasta 150 kg/ha, las habas forrajeras y la soja hasta 250 kg/ha, el lupino blanco hasta 300 kg/ha de nitrógeno, con un rendimiento de 3-4 t/ha de semillas. Sin embargo, en la práctica rara vez se logran condiciones óptimas; la actividad de la simbiosis se debilita y solo se fijan 20-60 kg/ha de nitrógeno del aire con un rendimiento de 1,2-1,5 t/ha. A veces, debido a la acidez excesiva del suelo, la falta de humedad o de nutrientes, no se produce fijación de nitrógeno y las plantas dan rendimientos bajos con un contenido mínimo de proteína.

Los datos sobre la entrada de nitrógeno en el suelo con las precipitaciones atmosféricas también son insuficientes. Esta magnitud varía de 2 a 20 kg/ha al año. Hasta el 90% del nitrógeno que entra con las semillas es utilizado por la cosecha. Con las semillas de leguminosas de grano se aportan de 8 a 15 kg/ha de nitrógeno, y con las de cereales de espiga, 4-6 kg/ha.

Están algo mejor estudiadas las cuestiones de las partidas de gasto del balance de nitrógeno. Numerosos trabajos de varios autores han mostrado que el nitrógeno de los fertilizantes en distintos suelos se utiliza en un 50-60% en experimentos de vegetación y en un 40-50% en campo. Sin embargo, al determinar los coeficientes de utilización de nutrientes, es de suma importancia el estudio de una nutrición equilibrada de las plantas con todos los elementos necesarios.

Según V. K. Shilnikov y E. Ya. Serov, la reserva a escala mundial de la fijación de nitrógeno de los ecosistemas terrestres y acuáticos son las algas verdeazuladas y los diazótrofos fotosintéticos. Algunas especies de cianobacterias forman asociaciones con hongos (líquenes) y plantas superiores, por ejemplo, asociaciones simbióticas con el helecho flotante azolla (Azolla spp.). La eficacia de muchos microorganismos fijadores de nitrógeno aerobios aumenta a una presión de oxígeno inferior a 2,02⋅10⁴ Pa. Por eso, en el agua marina y subterránea, en los suelos de arrozales inundados y en fuentes termales pueden darse condiciones favorables para la fijación de nitrógeno por microorganismos aerobios.

La filósfera, es decir, la superficie de las hojas de las plantas, también sirve como nicho de fijación no simbiótica heterótrofa de nitrógeno atmosférico por microorganismos. Su contribución al balance general de acumulación de nitrógeno se estima en 13-15%, y la capacidad de fijación de nitrógeno de los microorganismos filósferos, en 55%.

D. N. Pryanishnikov prestó gran atención al balance de nitrógeno como criterio de fertilidad del suelo y rendimiento de los cultivos. Fue el primero que calculó el balance de nitrógeno en la URSS. En 1937, el déficit de nitrógeno era de aproximadamente el 70%. Según sus cálculos, en 1940 la mayor parte del nitrógeno devuelto a las tierras provenía: con estiércol — hasta 14,8%, con raíces de leguminosas — 8,2%, con fertilizantes minerales — 3,2%, en total — 26,2%. El resto, 73,8%, constituía el déficit.

El estudio de los procesos de fijación microbiológica de nitrógeno permitirá utilizarlo de manera más eficaz en la agricultura.

Entre las cuestiones prácticas más importantes del nitrógeno biológico que requieren estudio se encuentran:

1. Los aspectos ecológico-biológicos y agronómicos del proceso para el aprovechamiento pleno y la intensificación de la fijación de nitrógeno.
2. El estudio de los mecanismos de fijación biológica en condiciones suaves para desarrollar nuevos métodos de obtención de fertilizantes nitrogenados y procedimientos de regulación de los procesos de fijación de nitrógeno.
3. Las investigaciones genético-selectivas de la simbiosis de plantas leguminosas con bacterias nodulares, así como la aplicación de la ingeniería genética, los logros de la bioquímica y la biología molecular para extender los procesos de fijación de nitrógeno a muchos cultivos agrícolas.

Lista de fuentes

1. Yagodin B. A., Zhukov Yu. P., Kobzarenko V. I. Agrochimie. / Bajo la dirección de B. A. Yagodin. M.: Kolos. 2002.
2. Vavilov P. P., Gritsenko V. V., Kuznetsov V. S. et al. Producción vegetal / Bajo la dirección de Vavilov P. P. 5ª ed., revisada y ampliada. M.: Agropromizdat 1986