La fijación de nitrógeno, o fijación microbiológica del nitrógeno atmosférico, es el proceso de absorción del nitrógeno atmosférico por parte de los microorganismos del suelo y su transformación en sustancias orgánicas y minerales.
El estudio de la fijación de nitrógeno fue realizado por J. Bussengo, M. Beyernik, G. Gelrigel, G. Vilfort, M.S. Voronin, S.N. Vinogradsky, V.L. Omelyansky, D.N. Pryanishnikov, D.I. Mendeleev, K.A. Timiryazev.
“Hay pocos fenómenos en los que el papel mutuo de la teoría y la práctica esté tan claramente definido como en aquellos estudios en los que las cuestiones científicas sobre el origen del nitrógeno en las plantas se fusionan inextricablemente con cuestiones puramente prácticas sobre los beneficios del cultivo del trébol y las leguminosas en general. ”
K. A. Timiryazev, 1890
La ciencia agrícola nacional prestó gran atención al estudio del fenómeno de la fijación del nitrógeno: se ha creado una colección de las cepas microbianas más eficaces, se han llevado a cabo estudios genéticos y de reproducción genética desde finales de los años 50, que fueron tratados por primera vez en la literatura nacional en la monografía «Genética de la fijación simbiótica del nitrógeno con fundamentos de selección» editada por I.A. Tikhonovich y N.A. Provorov en 1998.
Aunque existen otras formas de convertir el nitrógeno atmosférico en nitrato, como durante las tormentas, el proceso por el que las plantas son capaces de fijar el nitrógeno se denomina fijación biológica del nitrógeno (BNF, por sus siglas en inglés). Los detalles del mecanismo de la BNF han sido descritos por Howard y Rees (1996) y muchos otros.
Importancia de la fijación de nitrógeno
El nitrógeno representa el 78,09% del aire atmosférico. Sobre 1 hectárea de superficie terrestre o acuática de la Tierra hay unas 80 mil toneladas de nitrógeno, inaccesible para la mayoría de las plantas superiores.
Los átomos de nitrógeno de la molécula de N2 están unidos por un enlace triple N≡N muy fuerte, por lo que romper este enlace consume mucha energía. En la industria, este proceso (proceso Haber-Bosch) para formar amoníaco se produce a altas temperaturas y presiones, lo que se asocia a elevados costes energéticos, mientras que en los sistemas biológicos — a presión y temperatura atmosféricas normales.
El nitrógeno es un elemento fundamental en la nutrición de los cultivos, y en ausencia de nitrógeno el crecimiento de los cultivos se ve gravemente afectado por la clorosis general y la reducción de la capacidad fotosintética. En la mayoría de los sistemas agrícolas, el nitrógeno (N) se aplica en una forma fácilmente disponible, ya sea como nitrato en fertilizantes químicos o como estiércol o compost, donde la descomposición microbiana puede liberar formas solubles de nitrato, que luego son absorbidas por el cultivo en crecimiento. En la agricultura comercial a gran escala, la mayor parte del nitrógeno se aplica en forma de fertilizantes producidos químicamente o a partir de fuentes minerales no renovables. Un problema adicional surge del uso de fertilizantes aplicados, donde el exceso de productos químicos se filtra del suelo a través de la lluvia o el riego y llega a los cursos de agua y las cuencas hidrográficas.
En condiciones naturales, cuando los niveles de nitrógeno mineral del suelo son bajos, las leguminosas tienen especial éxito por su capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico en una forma que pueden utilizar para su crecimiento normal. Otras plantas con esta característica, como las especies Gunnera, Alnus, Casuarina y Mirica, mantienen una relación simbiótica con los organismos del suelo que colonizan sus raíces. La simbiosis entre plantas y organismos beneficiosos, como muestra el registro fósil, ha sido un factor importante en el éxito de la propagación de las plantas. Aunque se han caracterizado los genes necesarios para señalar el inicio de la colonización de las raíces, el origen de estos genes sigue sin estar claro (Delaux et al., 2015).
En función de sus fuentes de energía, los microorganismos fijadores de nitrógeno se clasifican en: autótrofos y heterótrofos.
Se estima que la fijación total de nitrógeno al año en los ecosistemas terrestres es de 175-190 millones de toneladas de nitrógeno, de las cuales 90-110 millones corresponden a los suelos agrícolas (Mishustin, 1983). Al mismo tiempo, la eliminación anual de nitrógeno de los suelos con productos agrícolas es de 110 millones de t. Otras estimaciones sitúan la fijación mundial anual de N entre 50 y 140 millones de toneladas (Unkovich et al., 2008). Recientemente, Baddeley et al. (2013) estimaron que alrededor de 0,8 millones de toneladas de N se fijaron en la UE en 2009.
Las leguminosas tienen una relación específica con las bacterias del suelo del género Rhizobium, en la que las bacterias penetran en las raíces, dando lugar a un proceso de conversión del nitrógeno atmosférico en nitrógeno soluble. La capacidad de simbiosis con Rhizobium es una de las principales razones por las que las leguminosas se caracterizan como «plantas pioneras», ya que suelen colonizar suelos con bajo contenido en nitrógeno y a menudo en entornos desnudos y abiertos (Cloutier et al., 1996). Los cultivos con esta capacidad de formar relaciones simbióticas son una de las principales fuentes de nitrógeno en los sistemas agrícolas con pocos recursos. Las leguminosas son, por tanto, cultivos de gran importancia económica.
Después de la cosecha, cuando la mayor parte del nitrógeno fijado en forma de proteína se elimina del campo, queda un nivel residual de nitrógeno en el follaje, el sistema radicular y los nódulos. Cuando se deja que las raíces se descompongan en el suelo, el nitrato se libera lentamente y está disponible para ser absorbido por el siguiente cultivo. Estos niveles pueden variar considerablemente, pero se reconoce que rondan los 20-50 kg N/ha (Sylvester-Bradley y Cross, 1991), como confirman Ward y Palmer (2013). En el caso de las judías forrajeras, las estimaciones realizadas en el Reino Unido sugieren una fijación de 60-100 kg N/ha en los residuos de tallos y raíces tras la cosecha (Iannetta et al., 2015).
Esta fuente de N es económicamente valiosa en el sistema de cultivo porque proporciona una fuente de N inmediata para el siguiente cultivo. Dado que el N fijado se libera con relativa lentitud en el suelo, el riesgo de lixiviación en periodos húmedos es menor que con la aplicación de fertilizantes, pero igual de importante es que el N residual disponible para el siguiente cultivo reduce las necesidades de N en unos 50 kg/ha. Además, la inclusión de un cultivo de leguminosas en la rotación proporciona una «pausa» en un sistema predominantemente cerealista, reduciendo la acumulación de patógenos de los cereales como el ácaro (Gaeumannomyces graminis) y brindando la oportunidad de controlar malas hierbas perennes y gramíneas como la hierba negra (Alopecurus myosuroides), que ha desarrollado resistencia a los graminicidas de uso común. En la UE, se ha calculado que el rendimiento del trigo de invierno inmediatamente después de un cultivo de leguminosas aumenta entre 0,6 y 0,9 t/ha (Von Richtofen, 2006), y en Canadá se ha registrado una respuesta similar (Wright, 1990). En algunos estudios con judías forrajeras (V. faba), su inclusión en la rotación de cultivos aumenta la diversidad de la flora y fauna silvestres, así como la microflora del suelo (Kopke y Nemecek, 2010). Por lo tanto, existen pruebas sólidas a favor de una rotación en el campo apoyada por la inclusión de un cultivo de leguminosas (Iannetta et al., 2013).
La intensidad de la fijación de nitrógeno
La eficiencia está influida por el estado del nitrógeno en el suelo. Esto es particularmente evidente cuando los niveles de nitrógeno inorgánico en el suelo son elevados y esto suprime la formación natural de clavo y la fijación de nitrógeno (Slattery et al., 2004). El experimento realizado por B.A. Yagodin junto con Yu.Ya. Mazel y Yu.G. Sazonov en 1981 mostró la dependencia de la fijación simbiótica de nitrógeno en el suministro de nitrógeno a las plantas y la intensidad de la fotosíntesis. En este experimento, se cultivaron 4 altramuces de crecimiento rápido bajo diferentes niveles de disponibilidad de nitrógeno y sombra de 1, 3 y 6 días. La iluminación cambió 1000 veces. El sombreado condujo a una disminución en la fijación de nitrógeno, en mayor medida, con un alto contenido de nitrógeno mineral. Después de 6 días de sombreado, la fijación de nitrógeno en la variante sin nitrógeno disminuyó 40 veces, en la variante con media dosis, se detuvo por completo, y con dosis doble, la fijación de nitrógeno ya se detuvo después de 3 días de sombreado.
La máxima intensidad de fijación de nitrógeno se observó en la fase de floración en las variantes sin nitrógeno y la mitad de la dosis. En la fase de brotación a la mitad de la dosis fue mayor que en la variante sin nitrógeno. Esto se debe a que una pequeña dosis inicial de nitrógeno contribuye a un mejor desarrollo de los nódulos en las primeras etapas de desarrollo. En la fase de floración en la variante sin nitrógeno, este indicador fue mayor que en la variante con nitrógeno.
En la fase de brotación, la máxima fijación de nitrógeno en el ciclo diario se produjo en las horas de la mañana (8 h), y en la variante con media dosis la fijación fue más rápida que en la variante sin nitrógeno. En la fase de floración, el máximo fue al mediodía. En este caso, fue el más grande de la variante sin nitrógeno. Con una mayor dosis de nitrógeno, este indicador disminuyó en todas las fases del desarrollo.
En la variante sin nitrógeno se observó una ingesta más intensa de productos etiquetados con 14 C. Con una dosis doble, fue un 20% menos. 30 min después de la exposición, se detectó el marcador en los nódulos de ambas variantes (0,37 y 0,07, respectivamente, de la actividad total). Durante 2,5 horas, en la variante sin nitrógeno, entraron 7 veces más productos en los nódulos que en la variante con nitrógeno, 5 veces más en las raíces y 2 veces más en los tallos.
La tasa desigual de recepción de productos de la fotosíntesis en los nódulos de la raíz a diferentes niveles de nutrición nitrogenada afectó la intensidad de la fijación de nitrógeno. Debido a la acumulación de productos de fotosíntesis en la variante con nitrógeno, el sombreado durante 3 días suprimió la fijación de nitrógeno de los nódulos.
Por lo tanto, el sombreado del lupino conduce a una disminución de la fijación de nitrógeno, pero en la variante en el contexto del nitrógeno mineral, esta disminución es mayor que sin nitrógeno.
El coeficiente de fijación de nitrógeno oscila entre 0,3 y 0,85.
La intensidad de la fijación de nitrógeno por bacterias de vida libre depende del suministro de sustancias orgánicas fácilmente disponibles que sirven como fuente de energía. Por ejemplo, la actividad de fijación de nitrógeno en la zona de raíces de las plantas debido a la fijación asociativa de nitrógeno es de 3 a 200 veces mayor que en los suelos entre hileras. Por lo tanto, las plantas son el factor principal en la actividad de las bacterias diazotróficas en la rizosfera debido a la exudación y caída de raíces, cuyo volumen es del 25 al 50% de la producción de fotosíntesis.
La intensidad de la fijación de nitrógeno en los diazótrofos está determinada por la actividad excretora de los sistemas de raíces de las plantas, es decir, en última instancia, por la actividad fotosintética.
La alta actividad en la rizósfera de muchas plantas tropicales está asociada con la capacidad de utilizar la ruta del ácido C-4-dicarboxílico en la fotosíntesis. Las plantas de este tipo requieren una luz intensa y su tasa máxima de fotosíntesis es mucho más alta que la de las plantas que utilizan el ciclo de Calvin (tipo C-3). Dado que las plantas con tipo C-4 consumen menos carbohidratos para la fotorrespiración, algunos de ellos se utilizan para el crecimiento y la exudación de las raíces.
La fijación de nitrógeno no simbiótica ha sido estudiada por muchos investigadores, pero hay poca información sobre su escala en varias zonas edafoclimáticas, debido a que en condiciones naturales este proceso depende de una serie de factores ambientales dinámicos.
Así, según una serie de estudios de suelos fértiles en campos de arroz, se ha demostrado que, como resultado de la fijación no simbiótica, se acumulan 60-70 kg/ha de nitrógeno al año bajo el arroz. Además, en suelos inundados se registran 57-63 kg/ha de nitrógeno, y en suelos no inundados — 3-7 kg/ha, sin plantas en suelos inundados — 23-28 kg/ha de nitrógeno.
Durante 3 meses de vegetación, la fijación de nitrógeno en los suelos de los campos de arroz en el Territorio de Krasnodar fue de 9-27 kg. La introducción de paja en el suelo promueve la reproducción de varios grupos de bacterias fijadoras de nitrógeno y el crecimiento de la fijación de nitrógeno hasta 20-40 kg/ha por mes. La humedad también contribuye a aumentar la actividad en la descomposición de la paja y la celulosa. En suelos intrazonales con exceso de humedad, es decir, llanuras aluviales, suelos pantanosos y plantaciones de arroz, la actividad es más alta: de 16,5 a 67,5 kg/ha por mes. En los suelos de la zona tropical, la fijación de nitrógeno no simbiótica promedia los 200 kg/ha por año, alcanzando a veces los 600 kg/ha por año.
La actividad de fijación de nitrógeno no simbiótica también depende de: la humedad, la temperatura, la composición granulométrica del suelo, el grado de aireación de la capa de raíces, el contenido de dióxido de carbono y la presencia de macro y microelementos. Los fertilizantes minerales, el encalado y las condiciones del aire también afectan la intensidad, pero se nota una alta eficiencia cuando la humedad, la temperatura y la materia orgánica no limitan la fijación de nitrógeno. La introducción de residuos de plantas en suelos sódico-podzólicos permite aumentar de 2 a 5 veces la actividad de fijación de nitrógeno, siempre que haya suficiente humedad.
La temperatura afecta a la tasa de fijación del nitrógeno y las temperaturas extremadamente altas o bajas reducen la eficacia. La fijación de N en las leguminosas es sensible al exceso de agua (James y Crawford, 1998), a la sequía y a los niveles de salinidad del suelo en combinación con un pH elevado. Las deficiencias en minerales clave también pueden limitar la fijación del nitrógeno, especialmente el fósforo (P). En las especies de Medicago, el tamaño y el peso de los nódulos se redujeron en la deficiencia de P (Schultze y Drevon, 2005).
Los fertilizantes nitrogenados minerales tienen un efecto regulador sobre la fijación de nitrógeno. Experimentos in vitro han mostrado inhibición de la fijación de nitrógeno en presencia de nitrógeno unido (en ausencia de plantas).
La inhibición se observa a dosis de nitrógeno combinado de más de 500-1000 kg/ha. Las dosis de fertilizantes, que generalmente se usan en la agricultura, provocan una supresión a corto plazo de la fijación de nitrógeno. Al mismo tiempo, los fertilizantes nitrogenados estimulan el desarrollo de las plantas, aumentan la productividad de la fotosíntesis y aumentan la exoósmosis, contribuyendo así a la fijación asociativa de nitrógeno en las etapas posteriores del desarrollo de la planta, cuando el exceso de nitrógeno del fertilizante mineral en el suelo se reduce significativamente.
El uso del método radiométrico en estudios de la cantidad de materia orgánica en rastrojos y residuos radiculares permitió revelar que, debido a las excreciones radiculares durante el período vegetativo y a la constante muerte de parte del sistema radicular, 3-4 veces más queda materia orgánica en el suelo después de la cosecha que cuando se determina este indicador por métodos convencionales. Al calcular la materia orgánica, también se deben tener en cuenta los órganos de las plantas muertas in vivo sobre el suelo.
En simbiosis con las bacterias del nódulo, las leguminosas pueden satisfacer hasta el 60-90% de sus necesidades de nitrógeno. Cultivos anuales de leguminosas, por ejemplo, altramuces, guisantes, fijan 50-100 kg/ha de nitrógeno por temporada, la mitad del cual permanece en el suelo, leguminosas perennes (trébol , alfalfa) — 180-300 kg/ha, de las cuales con raíces y restos de cosecha en el suelo 70-100 kg/ha.
Bacterias fijadoras de nitrógeno
Los fijadores de nitrógeno autótrofos son las cianobacterias y las bacterias anaerobias fotosintéticas. Son importantes solo en condiciones de anegamiento y en suelos inundados, donde la fijación alcanza 20-50 kg/ha de nitrógeno por año.
Las bacterias heterótrofas fijadoras de nitrógeno se distribuyen en todo tipo de suelos en la rizósfera y filosfera de las plantas. De este grupo, las bacterias de los nódulos y su papel en la nutrición nitrogenada de las plantas leguminosas y el enriquecimiento del suelo con nitrógeno están bien estudiados. La contribución de otros fijadores de nitrógeno simbióticos heterótrofos, como los endosimbiontes de aliso y espino amarillo, aún no se conoce bien.
Las bacterias fijadoras de nitrógeno heterótrofas no simbióticas también son poco conocidas, aunque la capacidad de fijación de nitrógeno de los microorganismos se descubrió precisamente en representantes de este grupo. En los suelos de la zona templada, fijan hasta 3-5 kg/ha de nitrógeno al año. Se ha revelado una gran diversidad de especies y su amplia distribución en los suelos de todas las zonas climáticas, en la rizosfera y en la superficie de las plantas, en embalses, limos y sedimentos, en los intestinos de insectos, peces y animales superiores.
La capacidad de fijar nitrógeno se encontró en un gran número de bacterias de varios grupos sistemáticos. Además de azotobacter, clostridios y bacterias del nódulo, grupos de bacterias tienen esta capacidad: Arthrobacter , Bacillus , Erwinia , Klebsiella , etc. Los cultivos puros de microorganismos eucariotas, incluidos hongos y levaduras, no tienen actividad fijadora de nitrógeno, sin embargo, los cultivos mixtos de fijadores de nitrógeno con eucariotas se caracterizan por una mayor actividad nitrogenasa.
La actividad activa de las bacterias del nódulo está determinada por el color rosa o rojo de los nódulos; con poca actividad, los nódulos tienen un color blanco o verde pálido. Para potenciar su actividad, las semillas de cultivos de leguminosas se tratan con fertilizantes bacterianos , por ejemplo, rizotorfina o nitragina.
Las bacterias del nódulo son bastoncillos, en estado libre son aerobias estrictas y no son capaces de asimilar el nitrógeno del aire. Se han identificado varias especies de bacterias del nódulo, que difieren en el tipo de relación con la planta huésped. Algunos tipos de bacterias son capaces de infectar a un grupo de plantas leguminosas, otras son muy específicas y entran en simbiosis solo con cultivos individuales.
Rhizobium
No todas las especies de leguminosas están asociadas a la misma cepa o especie de la bacteria Rhizobium que habita en el suelo. La formación de nódulos no se producirá si la especie en cuestión no está presente en el suelo. Dentro de cada especie de Rhizobium, hay una serie de cepas específicas del hospedador. Normalmente, las especies Vicia y Pisum se asocian con Rhizobium leguminosarum, pero dentro de esta especie, se cree que diferentes cepas de la bacteria prefieren cada tipo de cultivo. Estudios recientes también han demostrado que existen dos clases genéticas diferentes de Rhizobium que infectan a Vicia faba (Del Egido, 2014). Phaseolus vulgaris está asociado con Rhizobium phaseoli; y las especies de altramuces, como otro ejemplo, tienen una asociación con Bradyrhizobium lupini.
En muchos casos, la especie/subespecie de Rhizobium que infecta a plantas huésped específicas está presente en el suelo, pero en algunas situaciones, especialmente en cultivos no autóctonos, las semillas pueden inocularse con preparados comerciales de cepas o especies de Rhizobium específicas para ese cultivo.
Especies de Rhizobium y su gama de hospedadores (Smartt, 1976):
- Rhizobium japonicum — soja (Glycine);
- Rhizobium leguminosarum — guisante (Pisum), veza (Vicia), lenteja (Lens), chena (Lathyrus);
- Bradyrhizobium lupini — altramuz (Lupinus);
- Rhizobium meliloti — meliloto (Melilota), alfalfa (Medicago), alholva (Trigonella);
- Rhizobium phaseoli — judías (Phaseolus);
- Rhizobium trifolii — trébol (Trifolium).
Fijación asociativa de nitrógeno
La fijación asociativa de nitrógeno es la fijación de nitrógeno en el fitoplano, es decir, la rizósfera y la filosfera de plantas no leguminosas. Por primera vez, la posibilidad de fijación de nitrógeno en la zona radicular de cultivos no leguminosos fue predicha en 1926 por S.P. Kostychev, posteriormente confirmado experimentalmente por estudios que utilizan el método del equilibrio (experimento de Bradbock (Inglaterra), experimento de Pryanishnikov, experimento de centeno «eterno» (Alemania)).
El cultivo permanente de no leguminosas no condujo a una disminución significativa en el contenido de nitrógeno en el suelo, a pesar de su alienación anual con la cosecha, al mismo tiempo, la cantidad de nitrógeno disminuyó continuamente en el barbecho. Durante la fijación asociativa de nitrógeno, los microorganismos y las plantas no entran en una interacción tal como en los sistemas simbióticos, sin embargo, en general, tiene las mismas características: la actividad de fijación de nitrógeno cambia con el desarrollo de las plantas, el máximo se alcanza durante los períodos de brotación y floración, y disminuye con la maduración.
Inicialmente, se prestó atención a la interacción de las bacterias fijadoras de nitrógeno (Spirillum, Lipoferum, Azospirillum brasilense, etc.) con el sistema radicular de las plantas de cereales tropicales. Sin embargo, la declaración sobre la singularidad de las propiedades de azospirillum resultó ser exagerada. En la actualidad se conoce acerca de la fijación de nitrógeno por la rizosfera del arroz, maíz, sorgo, trigo y algunos tipos de gramíneas tropicales. Se conocen más de 200 especies de no leguminosas que son capaces de fijar nitrógeno con la ayuda de microorganismos rizosféricos.
La fijación asociativa de nitrógeno es de gran importancia ecológica, debido a ella se repone el fondo de nitrógeno disponible en la mayoría de los ecosistemas naturales. Sin embargo, las bacterias del nódulo ( Rhizobium ) en simbiosis con las leguminosas muestran la mayor eficiencia: en condiciones óptimas, la fijación biológica de nitrógeno alcanza más de 300 kg/ha por año.
Mecanismo de fijación biológica de nitrógeno
A fines del siglo pasado, se hicieron varias suposiciones sobre los mecanismos de fijación de nitrógeno. Se consideraron dos opciones: oxidativa y reductora. D.N. Pryanishnikov creía que la transición de N2 a NH3 a través de los óxidos de nitrógeno era imposible, ya que contradecía el principio de ahorro de energía aceptable para los organismos. S.N. Vinogradsky, a fines del siglo pasado, sugirió un método para la unión reductora de nitrógeno molecular al amoníaco.
“El mecanismo del proceso de asimilación del nitrógeno se presenta en este caso como la acción del hidrógeno en el momento de su liberación sobre el nitrógeno gaseoso en el protoplasma vivo de la célula. La hipótesis de que la síntesis de amoníaco es un resultado directo de este proceso nos parece razonable”.
S.N. Vinogradsky «Sobre la asimilación del gas nitrógeno atmosférico por los microbios»
P.A. Kostychev desarrolló la teoría de S.N. Vinogradsky sobre la fijación reductora de nitrógeno molecular a través del amoníaco. En la actualidad, este mecanismo se considera generalmente aceptado.
Las bacterias de los rizobios (Rhizobiales), que están presentes en muchos suelos de todo el mundo, son estimuladas a infestar a través de los pelos radiculares o a través de grietas en la epidermis de las plantas huésped por exudados radiculares que contienen flavonoides que se liberan al suelo durante el crecimiento de las raíces (Sprent y James, 2007). Actualmente se están investigando los mecanismos genéticos implicados en el inicio de esta contaminación. Se ha demostrado que la presencia de calcio y la señalización asociada en los pelos radiculares es un factor importante en todo el proceso. Las bacterias rizobias fijadoras de nitrógeno, asociadas a las leguminosas, indican a sus huéspedes que inicien la simbiosis mediante la liberación de compuestos difusibles, entre ellos los lipo-chito-oligosacáridos, también conocidos como factores Nod. Inducen oscilaciones de iones de calcio en las células epidérmicas de la raíz (Sun et al., 2015). Los elementos básicos de esta señalización, que se están dilucidando en la investigación actual, serán la piedra angular para explorar la posibilidad de asociaciones simbióticas similares con cultivos no leguminosos (Oldroyd y Dixon, 2014).
Una vez establecidas en las raíces, las bacterias se multiplican y pasan a la corteza de la raíz a través de un hilo de infección, que es un tubo de paredes celulares. Las raíces responden a esta infección formando nódulos radiculares, que son el resultado de un agrandamiento de las células del tejido radicular.
El movimiento de las bacterias dentro de las raíces conduce a la formación de nuevos nódulos y, a medida que éstos envejecen, mueren, liberando rizobios en el suelo para invadir las nuevas raíces. Los nódulos proporcionan un nicho especializado que permite a los rizobios fijar el nitrógeno en condiciones mínimas de aire, lo que protege a la enzima nitrogenasa, pero permite que haya suficiente oxígeno para la respiración aeróbica asociada a la fijación del nitrógeno (Gallon, 1992; Minchin et al., 2008). El nódulo también permite a las bacterias simbióticas intercambiar eficazmente nitrógeno fijado a cambio de carbohidratos de la planta huésped. El nitrógeno se convierte primero en amoníaco utilizando la energía suministrada por el metabolismo de los carbohidratos (Emerich y Burris, 1978). A continuación, el amoníaco se convierte en aminoácidos, que las bacterias utilizan para producir las proteínas y peptonas necesarias para su crecimiento. El nitrógeno fijado incorporado a los rizobios se libera entonces en forma de aminoácidos, que son absorbidos por la planta huésped (White et al., 2007; Anderson et al., 2013).
La principal enzima responsable de la fijación de nitrógeno es la nitrogenasa. En las leguminosas, se concentra en las bacterias del nódulo. Las dificultades para aislar esta enzima de los organismos celulares retrasaron durante mucho tiempo el estudio de los procesos bioquímicos de fijación de nitrógeno. La nitrogenasa se puede aislar solo en ausencia de aire.
Por primera vez, se obtuvieron extractos libres de células de nódulos de soja en 1968 en el laboratorio de Evans. En la URSS, se aisló por primera vez un complejo enzimático (nitrogenasa) a partir de bacteroides de nódulos de lupino y soja en 1970.
La nitrogenasa consta de dos estructuras proteicas: una, con un peso molecular de 164 000, contiene molibdeno y hierro, la segunda, con un peso molecular de 56 000, contiene solo hierro. Individualmente, estas estructuras no fijan nitrógeno molecular.
En la mayoría de los microorganismos, la nitrogenasa es inactivada por el oxígeno y la proteína Fe es más sensible al oxígeno que la proteína Mo-Fe. La proteína Fe también es muy sensible al frío y se inactiva a 0 °C. La reacción bioquímica de reducción de nitrógeno requiere la presencia de ATP, una fuente de electrones e iones Mg2+. La mayoría de los científicos cree que se consumen 15 moléculas de ATP para fijar 1 molécula de nitrógeno.
Una característica distintiva de la nitrogenasa es la capacidad de reducir no solo el nitrógeno molecular, sino también otras moléculas con un triple enlace. Esta característica hizo posible utilizar el método para determinar la fijación de nitrógeno por la reducción de acetileno (HC≡CH) a etileno (H2C=CH2).
La bioquímica de la nitrogenasa no se comprende completamente. Por ejemplo, no se sabe cómo se combina la energía de la hidrólisis del ATP con la transferencia de electrones, cómo se produce la reducción de la molécula de nitrógeno y no está claro el mecanismo de participación del hierro y el molibdeno en este proceso. La necesidad de molibdeno en las Azotobacter fijadoras de nitrógeno es mucho mayor que en las especies reductoras de nitratos.
Otras enzimas que contienen metales también participan en la fijación simbiótica de nitrógeno, por ejemplo, la leghemoglobina, que se localiza en las células vegetales. Está presente en los nódulos como producto de la simbiosis entre bacterias y plantas superiores, pero la actividad de fijación de nitrógeno depende de su concentración en los nódulos.
La nitrogenasa es muy sensible al oxígeno, pero los rizobios necesitan oxígeno para respirar. Los nódulos contienen una alta concentración de hemoglobina pulmonar, que transporta oxígeno y rodea a las bacterias en los nódulos infectados. Esta hemoglobina pulmonar es capaz de transferir oxígeno en bajas concentraciones a las bacterias, por lo que su presencia en los nódulos es esencial. En condiciones anaeróbicas o en suelos encharcados, la tasa de fijación del nitrógeno se reduce considerablemente y se requiere un tipo de suelo bien aireado para que la fijación biológica del nitrógeno sea eficaz.
La función de la leghemoglobina es similar a la función de la hemoglobina y consiste en la adición reversible de oxígeno. La leghemoglobina es un transportador de oxígeno, no participa en la reducción de nitrógeno, pero participa en los procesos de formación de energía ATP, que proceden con la participación de oxígeno, y al mismo tiempo le permite mantener las condiciones anaeróbicas para el trabajo de la nitrogenasa. . El mecanismo para proteger a la nitrogenasa del oxígeno es complejo y la leghemoglobina es probablemente solo uno de los eslabones de este proceso.
Los fijadores de nitrógeno anaeróbicos presumiblemente tienen varios mecanismos para proteger la nitrogenasa del oxígeno. Por ejemplo, la altísima actividad respiratoria de Azotobacter es un sistema de defensa contra la inactivación del oxígeno.
Otro método propuesto es la «protección conformacional de la nitrogenasa», es decir, un cambio espacial en el componente proteico de la nitrogenasa en presencia de oxígeno.
Los corinoides, compuestos del grupo de la vitamina B12, incluido el cobalto, participan en la fijación de nitrógeno. La necesidad de cobalto se demostró en experimentos sobre el cultivo simbiótico de leguminosas en medios nutritivos desprovistos de nitrógeno, y se estableció por el hecho de un efecto positivo sobre la actividad de fijación de nitrógeno. En los nódulos, los corrinoides están presentes en las bacterias del nódulo (bacteroides) y en el tejido vegetal del nódulo.
Tabla. Contenido en los nódulos de las sustancias que intervienen en la fijación del nitrógeno
| Vitamina B12 en nódulos de lupino, mg/g | ||
| Coenzimas de cobamida en células de Rhizobium melitoli, miles de mmol/g | ||
| Hemoglobina en nódulos de frijol (según Shemakhanova), mg/g de peso seco | ||
| Ácido desoxirribonucleico en nódulos de lupino, mg/g |
El papel bioquímico de la vitamina B12 en la fijación de nitrógeno ha sido poco estudiado, se sabe que los compuestos del grupo B12 forman parte de las enzimas metilmalonil-CoA mutasa y ribonucleótido reductasa.
Los derivados de la vitamina B12 catalizan reacciones bioquímicas en las que el hidrógeno se transfiere entre dos átomos de carbono adyacentes mientras se mueven otros grupos en la dirección opuesta.
Aplicación de la fijación de nitrógeno en la agricultura
La proteína es el componente más importante de la alimentación humana y animal. En muchos países del mundo, por unidad de superficie, hay una gran escasez de proteínas en la dieta. Las legumbres por unidad de superficie te permiten obtener muchas más proteínas que los cereales. Así, la cantidad de proteína en las semillas de lupino y soja es 2-3 veces más que en el grano de trigo, centeno o avena, y 3-4 veces más que en el grano de arroz y maíz.
El coste de la proteína de las legumbres es 10 veces inferior al de la proteína de los cereales, mientras que se compone en un 80-90% de formas fácilmente digeribles, más completas en cuanto a la composición de aminoácidos.
Desde un punto de vista agronómico, las leguminosas también son de gran importancia, como cultivos que enriquecen los residuos de cultivos y acumulan nitrógeno en el suelo, aceleran la mineralización de los residuos vegetales y aumentan la tasa de utilización del nitrógeno del suelo.
De acuerdo con una larga experiencia realizada en la Academia Agrícola de Moscú. K.A. Timiryazeva B.A. Dospekhov, en suelo sódico-podzólico, la introducción del trébol en la rotación de cultivos aumentó el rendimiento del centeno en 0,75 t/ha y, además, al usar fertilizantes de fósforo y potasio , en 1,18 t/ha. Un efecto aún mayor se logró con el uso de encalado a dosis de 1 t/ha en suelo sin fertilizar. Las leguminosas perennes contribuyen a la formación de estructuras, previenen el desarrollo de procesos de erosión y cumplen una función fitosanitaria. Por ejemplo, la alfalfa suprime el agente causante de la marchitez por verticillium en el algodón ., por lo que se introduce mediante rotaciones de cultivos de algodón.
La eficiencia del uso máximo de nitrógeno biológico depende de la acidez del suelo, es decir, el uso de encalado, la aplicación de fósforo, fertilizantes potásicos y algunos microfertilizantes.
Al resolver problemas prácticos relacionados con la nutrición nitrogenada, la participación del nitrógeno biológico en el balance de nutrientes ocupa un lugar importante.
Los datos sobre la magnitud de la fijación simbiótica de nitrógeno son diferentes. Por ejemplo, según A.V. Sokolov, la cantidad de nitrógeno fijada por el trébol varía del 45 al 95%, según V.E. Shevchuk, las leguminosas fijan solo un tercio del nitrógeno de la atmósfera, según E.N. Mishustin, se acumulan alrededor de 100 kg/ha de nitrógeno en los residuos de raíces de alfalfa y 50 kg/ha de trébol por año.
Según N. S. Avdonin, en base a los datos de D.N. Pryanishnikov sobre la capacidad del trébol para fijar 150 kg/ha de nitrógeno por año, alfalfa — 250-300 kg/ha, el valor de la asimilación simbiótica de nitrógeno molecular puede alcanzar los 3 millones de toneladas, según los cálculos de E.N. Mishustin — alrededor de 3,5 millones de toneladas A escala de la biosfera, el papel de la fijación simbiótica de nitrógeno es pequeño, ya que las leguminosas representan alrededor del 10% del área total de cultivos agrícolas, y son mucho menos en las fitocenosis naturales.
En condiciones favorables de simbiosis, es decir, a pH sol 6-7, disponibilidad de fósforo, potasio, magnesio, boro, molibdeno, presencia de cepas virulentas específicas de bacterias nodulares, humedad óptima del suelo, el guisante fija hasta 150 kg/ha , habas forrajeras y soja — hasta 250 kg/ha, lupino blanco — hasta 300 kg/ha de nitrógeno, mientras que el rendimiento es de 30-40 kg/ha de semillas.
Sin embargo, en la práctica, rara vez es posible proporcionar condiciones óptimas, la actividad de simbiosis se debilita y solo se fijan 20–60 kg/ha de nitrógeno del aire con un rendimiento de 1.2–1.5 t/ha. A veces, debido a la acidez excesiva del suelo , la falta de humedad o nutrientes, la fijación de nitrógeno no se produce, las plantas dan bajos rendimientos con un mínimo de proteína.
Los datos sobre la entrada de nitrógeno en el suelo con la precipitación atmosférica también son insuficientes. Este valor varía de 2 a 20 kg/ha por año. El cultivo utiliza hasta el 90% del nitrógeno suministrado con las semillas. Se aplica de 8 a 15 kg/ha de nitrógeno con semillas de leguminosas, 4-6 kg/ha de cereales.
Los temas de las partidas de gasto del balance de nitrógeno se han estudiado algo mejor. Numerosos trabajos de varios autores han demostrado que el nitrógeno fertilizante en varios suelos se usa en un 50-60% en experimentos de vegetación y en un 40-50% en experimentos de campo. Sin embargo, a la hora de determinar los factores de utilización de nutrientes, es de suma importancia estudiar la nutrición equilibrada de las plantas con todos los elementos necesarios.
Según V.K. Shilnikova y E.Ya. Serov, la reserva mundial de fijación de nitrógeno de los ecosistemas terrestres y acuáticos son las algas verdeazuladas y los diazótrofos fitosintéticos. Algunas especies de cianobacterias forman asociaciones con hongos (líquenes), plantas superiores, como asociaciones simbióticas con el helecho acuático Azolla . La eficiencia de muchos microorganismos aeróbicos fijadores de nitrógeno aumenta a una presión de oxígeno de menos de 2.02 ⋅ 104 Pa. Por lo tanto, en el agua de mar y subterránea, en los suelos de los campos de arroz inundados, en las fuentes termales, pueden desarrollarse condiciones favorables para la fijación de nitrógeno por parte de los microorganismos aeróbicos.
La filosfera, es decir, la superficie de las hojas de las plantas, también sirve como nicho para la unión heterótrofa no simbiótica del nitrógeno atmosférico por parte de los microorganismos. Su contribución al equilibrio general de la acumulación de nitrógeno se estima en un 13-15 %, y la capacidad de fijación de nitrógeno de los microorganismos filosféricos es del 55 %.
D.N. Pryanishnikov prestó gran atención al balance de nitrógeno como criterio de fertilidad del suelo y rendimiento de los cultivos. Fue el primero en calcular el balance de nitrógeno en la URSS. En 1937, el déficit de nitrógeno era de alrededor del 70%. Según sus cálculos, en 1940, la mayor parte del nitrógeno devuelto a la tierra provino: con estiércol , hasta el 14,8%, con raíces de leguminosas, el 8,2%, con fertilizantes minerales, el 3,2%, en total, el 26,2%. El 73,8% restante era deficitario.
El estudio de los procesos de fijación microbiológica del nitrógeno permitirá su uso más eficaz en la agricultura.
Los aspectos prácticos más importantes del nitrógeno biológico que requieren estudio incluyen:
- Aspectos ecológicos, biológicos y agronómicos del proceso para el pleno aprovechamiento e intensificación de la fijación de nitrógeno.
- Estudio de los mecanismos de unión biológica en condiciones templadas para desarrollar nuevos métodos de obtención de fertilizantes nitrogenados y métodos de regulación de los procesos de fijación de nitrógeno.
- Estudios de mejoramiento genético de la simbiosis de plantas leguminosas con bacterias nódulos, así como el uso de la ingeniería genética, los logros de la bioquímica y la biología molecular para extender los procesos de fijación de nitrógeno a muchos cultivos agrícolas.
Literatura
Yagodin B.A., Zhukov Yu.P., Kobzarenko V.I. Agroquímica / Ed. LICENCIADO EN LETRAS. Yagodina. — M.: Kolos, 2002. — 584 p.: il.
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Peas and beans. Crop production science in horticulture / Antony J. Biddle. 2017. UK.
