DNA barcoding y taxonomía digital

1.1. Introducción: la crisis de identificación en la era de la biodiversidad

La sistemática y la taxonomía modernas se enfrentan a una contradicción fundamental. Por un lado, la biodiversidad de la Tierra se estima en millones de especies, y una parte significativa de ellas aún no ha sido descrita (Hebert et al., 2003). Por otro lado, el número de taxónomos cualificados disminuye de forma constante, y la identificación morfológica de muchos grupos de organismos requiere conocimientos especializados que son cada vez más raros (Gaston and O'Neill, 2004). Esta situación, conocida como el «obstáculo taxonómico» (taxonomic impediment), se siente especialmente en áreas aplicadas: protección de plantas, cuarentena, control de calidad de productos y monitoreo de agrocenosis.

La identificación morfológica tradicional tiene una serie de limitaciones. A menudo requiere individuos adultos de un sexo o estadio vital determinado, no siempre es aplicable a material fragmentado y puede fallar en presencia de especies crípticas: taxones morfológicamente indistinguibles pero genéticamente diferentes (Bickford et al., 2007). Además, los caracteres morfológicos pueden estar sujetos a una variabilidad intraespecífica significativa dependiente de las condiciones ambientales, lo que dificulta el establecimiento de límites claros entre especies (Meyer and Paulay, 2005).

En este contexto, la idea de utilizar regiones cortas y estandarizadas de ADN para la identificación de especies —el DNA barcoding— ofreció un enfoque fundamentalmente nuevo para resolver las tareas de diagnóstico. Esta tecnología no sustituye a la taxonomía tradicional, pero proporciona una poderosa herramienta adicional que permite identificar organismos de forma rápida y objetiva a partir de su información genética (Hebert et al., 2003; CBOL Plant Working Group, 2009).

1.2. Definición y fundamento conceptual del DNA barcoding

El DNA barcoding es un método de identificación de especies basado en el uso de una región corta y estandarizada de ADN (normalmente 400–800 pares de bases) que sirve como «código de barras» molecular para un taxón determinado (Hebert et al., 2003; Kress and Erickson, 2007). El término «código de barras» (barcode) se tomó del comercio, donde el código universal de producto (UPC) identifica inequívocamente un producto. De manera análoga, la secuencia de nucleótidos de un gen determinado se considera un identificador único de la especie.

El fundamento conceptual del método se basa en varias proposiciones clave:

Primera. Existen regiones del genoma que son lo suficientemente conservadas como para poder ser amplificadas con cebadores universales en una amplia gama de organismos y, al mismo tiempo, lo suficientemente variables como para distinguir especies cercanas (Hebert et al., 2003).

Segunda. La divergencia genética interespecífica del marcador elegido suele superar la variabilidad intraespecífica. Esta diferencia se denomina «brecha del código de barras» (barcode gap) (Meyer and Paulay, 2005).

Tercera. Existe la posibilidad de crear una base de datos de referencia global en la que cada secuencia corresponda a una especie determinada, identificada por un especialista taxónomo (Ratnasingham and Hebert, 2007).

Es importante subrayar que el DNA barcoding se diferencia fundamentalmente de la secuenciación completa del genoma. Mientras que la secuenciación completa tiene como objetivo obtener toda la información genética del organismo, el barcoding se centra en una pequeña región seleccionada exclusivamente con fines de identificación. Esta diferencia determina todas las ventajas y limitaciones del método.

1.3. Diferencias con la secuenciación completa del genoma

La secuenciación completa del genoma es un proceso laborioso y costoso que requiere importantes recursos computacionales para el ensamblaje y la anotación. Incluso con las tecnologías modernas, la secuenciación completa sigue siendo inaccesible para el diagnóstico rutinario de grandes muestras de organismos. El DNA barcoding, por el contrario, ofrece una solución pragmática: en lugar de toda la información genómica, obtenemos solo el volumen mínimo de datos suficiente para la identificación (Hebert et al., 2003).

Este enfoque tiene varias consecuencias importantes. En primer lugar, el barcoding no requiere conocer la secuencia completa del genoma: basta con determinar la secuencia de una región marcadora. En segundo lugar, el método es aplicable a organismos cuyos genomas están poco estudiados, lo que es especialmente importante para taxones poco investigados. En tercer lugar, la estandarización del marcador permite comparar datos obtenidos por diferentes laboratorios en diferentes países, lo que crea la base para la cooperación global (Ratnasingham and Hebert, 2007).

Cabe señalar que el DNA barcoding no está destinado a reconstrucciones filogenéticas de alta resolución. Aunque las secuencias de códigos de barras pueden utilizarse en análisis filogenéticos, su función principal es la identificación, no el establecimiento de relaciones de parentesco (Hajibabaei et al., 2007). Para los estudios filogenéticos se requieren secuencias más largas y, por regla general, varios loci independientes.

1.4. Ventajas del método

El DNA barcoding posee una serie de ventajas significativas que explican su amplia difusión en la sistemática moderna y en la investigación aplicada.

Rapidez. La identificación basada en el código de barras puede realizarse en cuestión de horas o días, mientras que la identificación morfológica de grupos complejos puede llevar semanas o meses. Con sistemas automatizados de secuenciación y pipelines bioinformáticos, el proceso se vuelve aún más rápido (Jain et al., 2016).

Estandarización. El uso de un marcador único para todo un grupo de organismos (por ejemplo, COI para animales) significa que los resultados obtenidos en diferentes laboratorios son directamente comparables. Esto elimina el problema característico de la identificación morfológica, donde diferentes especialistas pueden utilizar distintos caracteres diagnósticos (Hebert et al., 2003).

Posibilidad de automatización. El barcoding se presta bien a la automatización, desde la extracción de ADN hasta el análisis de secuencias. Esto es crítico para procesar grandes muestras, por ejemplo, en el monitoreo de la biodiversidad o en inspecciones cuarentenarias (Ratnasingham and Hebert, 2007).

Aplicabilidad a cualquier estadio del ciclo vital. A diferencia de las claves morfológicas, que a menudo solo funcionan para adultos de un sexo determinado, el barcoding permite identificar huevos, larvas, fragmentos de tejidos y otros materiales que carecen de caracteres morfológicos diagnósticos (Floyd et al., 2002).

Objetividad. El resultado de la identificación es una secuencia de nucleótidos que puede ser verificada y reproducida de forma independiente. Esto reduce la subjetividad inherente a la identificación morfológica (Collins and Cruickshank, 2013).

Posibilidad de trabajar con ADN degradado. El barcoding a menudo es posible incluso con una degradación significativa del ADN, lo que lo hace aplicable al análisis de productos procesados, muestras de herbario antiguas y ejemplares de museo (Staats et al., 2016).

1.5. Áreas de aplicación

Inicialmente, el DNA barcoding se propuso para la investigación taxonómica fundamental, pero pronto encontró una amplia aplicación en áreas aplicadas. Para la disciplina «Sistemática y taxonomía de organismos de la agroesfera», las siguientes direcciones son especialmente importantes.

Ecología y monitoreo de la biodiversidad. El barcoding permite evaluar rápidamente la riqueza de especies en diversos hábitats, incluidos los agrocenosis. El método es especialmente útil para inventariar grupos poco estudiados y detectar especies crípticas (Bickford et al., 2007; Deiner et al., 2017).

Cuarentena y bioseguridad. La identificación de especies invasoras y cuarentenarias es una de las áreas más demandadas de aplicación del barcoding. La determinación rápida y precisa de la especie es crítica para prevenir la propagación de organismos dañinos (Armstrong and Ball, 2005; Floyd et al., 2010).

Criminalística y peritaje forense. El barcoding se utiliza para identificar materiales biológicos en investigaciones forenses, incluido el comercio ilegal de especies amenazadas (Staats et al., 2016).

Control de calidad de productos. La determinación de la pertenencia específica de materias primas y productos terminados es una tarea importante de la industria alimentaria. El barcoding permite detectar falsificaciones, por ejemplo, la sustitución de especies de pescado caras por análogos más baratos (Galimberti et al., 2013).

Diagnóstico de enfermedades de plantas y plagas. En agronomía, el barcoding se utiliza para identificar patógenos, nematodos, insectos plaga y otros organismos importantes para la agricultura (Powers, 2004; Robideau et al., 2011; Choi et al., 2015).

1.6. Contexto histórico y desarrollo de la iniciativa

La idea de utilizar secuencias cortas de ADN para la identificación no era absolutamente nueva. Ya en la década de 1980 se intentó utilizar genes ribosomales para el diagnóstico de microorganismos (Janda and Abbott, 2007). Sin embargo, el desarrollo sistemático del concepto comenzó con la publicación de Hebert et al. (2003), donde se propuso el uso del gen de la citocromo oxidasa I (COI) como código de barras universal para animales.

En 2004 se creó el Consorcio para el Código de Barras de la Vida (Consortium for the Barcode of Life, CBOL), una organización internacional que unió institutos de investigación, museos y universidades de diferentes países. El objetivo del consorcio era crear una biblioteca de referencia global de códigos de barras para todas las especies de organismos vivos (Ratnasingham and Hebert, 2007).

En 2010 se lanzó la iniciativa International Barcode of Life (iBOL), un proyecto a gran escala destinado a obtener códigos de barras para millones de especies. Paralelamente se desarrolló la infraestructura informativa: el Barcode of Life Data System (BOLD), que se convirtió en la plataforma central para el almacenamiento, análisis y publicación de datos de barcoding (Ratnasingham and Hebert, 2007).

Para las plantas, la búsqueda de un código de barras universal resultó más difícil que para los animales. El gen mitocondrial COI, eficaz en animales, evoluciona demasiado lentamente en las plantas. Tras extensos estudios, en 2009 el CBOL Plant Working Group recomendó el uso de una combinación de dos genes plastídicos —rbcL y matK— como código de barras central para plantas terrestres (CBOL Plant Working Group, 2009). Posteriormente se propuso la adición de marcadores adicionales, como ITS y trnH-psbA, para aumentar la capacidad de resolución (China Plant BOL Group, 2011; Hollingsworth et al., 2011).

1.7. Lugar del DNA barcoding en el sistema de métodos taxonómicos

Es importante definir claramente el lugar del DNA barcoding en la metodología de la sistemática. No es un sustituto de la taxonomía morfológica tradicional ni una disciplina independiente. Más bien, es una herramienta que complementa y amplía las capacidades del investigador.

El barcoding no está destinado a:

• describir nuevas especies sin justificación morfológica;
• establecer relaciones filogenéticas de alta resolución;
• sustituir la experiencia taxonómica en la resolución de cuestiones nomenclaturales complejas.

El barcoding está destinado a:

• la identificación rápida de especies conocidas;
• la detección de especies potencialmente nuevas (flagging);
• la verificación de la pertenencia específica de muestras identificadas morfológicamente;
• proporcionar un enfoque estandarizado para el diagnóstico.

Esta distinción es de importancia fundamental, especialmente en el contexto de las críticas al método. Como señalan Collins and Cruickshank (2013), la confusión entre las tareas de identificación de muestras (specimen identification) y de descubrimiento de especies (species discovery) conduce a errores metodológicos y conclusiones injustificadas. La comprensión correcta de las capacidades y limitaciones del método es una condición necesaria para su uso eficaz.

1.8. Términos y conceptos clave

Para el estudio posterior del material es necesario dominar una serie de términos clave.

Código de barras (barcode) — una secuencia corta y estandarizada de ADN utilizada para la identificación de especies.

Brecha del código de barras (barcode gap) — la diferencia entre la divergencia genética intraespecífica máxima y la interespecífica mínima para un marcador determinado.

Base de datos de referencia (reference library) — una colección de secuencias de códigos de barras vinculadas a especímenes voucher identificados morfológicamente.

Voucher — una muestra física de la que se obtuvo la secuencia, conservada en una colección científica y disponible para su reexamen.

Mini-código de barras (mini-barcode) — un fragmento acortado de un código de barras estándar utilizado para el análisis de ADN degradado.

Metabarcoding — un método de análisis de mezclas complejas de organismos (por ejemplo, de suelo o agua) mediante secuenciación de alto rendimiento.

MOTU (Molecular Operational Taxonomic Unit) — unidad taxonómica operativa, definida sobre la base de la similitud genética, sin vinculación obligatoria a un nombre taxonómico formal.

2.1. Introducción: por qué no existe un marcador único

Una de las ideas centrales del DNA barcoding es la estandarización: el uso de una región única de ADN para la identificación de todos los organismos dentro de un grupo grande. Sin embargo, la biología de los diferentes taxones impone restricciones significativas a la elección de dicha región. La velocidad de la evolución molecular, la estructura del genoma, la presencia de intrones y repeticiones, la disponibilidad de cebadores universales: todo esto varía entre los reinos de la naturaleza viva. Como resultado, para cada grupo importante de organismos se han desarrollado marcadores estándar propios y, en algunos casos, combinaciones de varios loci (Hollingsworth et al., 2011; Schoch et al., 2012).

La elección del marcador está determinada por un compromiso entre dos requisitos opuestos. Por un lado, la región debe ser lo suficientemente conservada como para poder ser amplificada con cebadores universales en una amplia gama de especies. Por otro lado, debe poseer suficiente variabilidad para distinguir especies cercanamente relacionadas. Este compromiso no siempre se puede encontrar en un solo gen, lo que conduce al uso de enfoques multi-locus (CBOL Plant Working Group, 2009; China Plant BOL Group, 2011).

En este capítulo examinaremos los principales marcadores adoptados para diferentes grupos de organismos y discutiremos los criterios para su elección.

2.2. Animales: el gen mitocondrial COI

Para los animales se propuso como marcador estándar de código de barras una región del gen mitocondrial de la citocromo oxidasa I (COI, cox1) (Hebert et al., 2003). Esta elección no fue casual. El genoma mitocondrial de los animales posee una serie de propiedades que lo hacen conveniente para la identificación.

Ausencia de intrones. Los genes mitocondriales en los animales generalmente no contienen intrones, lo que simplifica la amplificación y el alineamiento de secuencias (Hebert et al., 2003).

Alta velocidad de evolución. Los genes mitocondriales evolucionan más rápido que los nucleares, lo que permite distinguir incluso especies que divergieron recientemente (Hebert et al., 2003; Cywinska et al., 2006).

Cebadores universales. Para COI se han desarrollado cebadores que funcionan en la mayoría de los grupos animales. La pareja clásica —LCO1490 y HCO2198— amplifica un fragmento de aproximadamente 658 pares de bases (Folmer et al., 1994; Hebert et al., 2003).

Haploidía y ausencia de recombinación. El ADN mitocondrial se hereda por vía materna y no está sujeto a recombinación, lo que simplifica la interpretación de los datos (Hebert et al., 2003).

La eficacia de COI se ha demostrado en una amplia gama de taxones. Por ejemplo, en un estudio de mosquitos de Canadá, la divergencia intraespecífica en COI fue en promedio del 0,5%, mientras que la interespecífica fue del 10,4% (Cywinska et al., 2006). Para los moluscos se ha demostrado que COI permite distinguir especies, pero en algunos grupos (por ejemplo, gasterópodos) la capacidad de resolución puede ser menor (Meyer and Paulay, 2005). No obstante, COI sigue siendo el marcador principal para animales, y la mayor base de datos de referencia, BOLD, contiene millones de secuencias de este gen (Ratnasingham and Hebert, 2007).

Es importante señalar que para algunos grupos animales COI puede ser ineficaz. Por ejemplo, en los cnidarios (Cnidaria) la velocidad de evolución de COI es menor, y este marcador no siempre distingue especies cercanas (Hebert et al., 2003). En tales casos se utilizan genes mitocondriales alternativos (por ejemplo, 16S ARNr) o marcadores nucleares como ITS (Schoch et al., 2012).

2.3. Plantas: búsqueda de un compromiso y enfoque multi-locus

La búsqueda de un código de barras universal para las plantas resultó considerablemente más difícil que para los animales. El gen mitocondrial COI en las plantas evoluciona demasiado lentamente para distinguir especies cercanas, y la estructura del genoma mitocondrial de las plantas es inestable (Kress and Erickson, 2007). Por ello, la atención de los investigadores se desplazó hacia los genomas plastídico y nuclear.

Tras extensos estudios comparativos, el CBOL Plant Working Group (2009) recomendó como código de barras central para plantas terrestres la combinación de dos genes plastídicos: rbcL y matK.

rbcL (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa, subunidad grande) es uno de los genes plastídicos más conservados. Se amplifica y secuencia fácilmente en la mayoría de las plantas, pero su capacidad de resolución a nivel de especie es limitada. No obstante, rbcL proporciona una asignación fiable de la muestra a familia o género y sirve como «ancla» para la comparación (CBOL Plant Working Group, 2009).

matK (maturasa cinasa) es uno de los genes plastídicos de evolución más rápida. Proporciona una resolución más alta a nivel de especie, pero su amplificación puede ser difícil debido a la falta de cebadores universales, especialmente en gimnospermas y plantas no florales (CBOL Plant Working Group, 2009; Hollingsworth et al., 2011).

La combinación rbcL + matK fue adoptada como estándar, pero estudios posteriores demostraron que para muchos grupos de plantas es insuficiente. El China Plant BOL Group (2011), con un gran conjunto de datos (6.286 muestras, 1.757 especies), demostró que la adición del marcador nuclear ITS (internal transcribed spacer) aumenta significativamente la capacidad de resolución. La combinación ITS + cualquier marcador plastídico permitía distinguir el 69,9–79,1% de las especies, mientras que rbcL + matK solo distinguía el 49,7%.

ITS (internal transcribed spacer) es un marcador ribosomal nuclear que posee alta variabilidad y se utiliza con frecuencia en filogenética de plantas. Sin embargo, su uso está limitado por posibles problemas con parálogos, polimorfismo y contaminación (China Plant BOL Group, 2011). Como alternativa más conveniente se propuso ITS2, un fragmento menor de ITS que se amplifica y secuencia con mayor facilidad (Chen et al., 2010).

Un marcador adicional para plantas es trnH-psbA, un espaciador intergénico del genoma plastídico. Se amplifica fácilmente y posee alta variabilidad, pero puede tener problemas de longitud y repeticiones mononucleotídicas (Kress and Erickson, 2007; Hollingsworth et al., 2011).

Así, para las plantas actualmente se recomienda utilizar el código de barras central rbcL + matK con la posible adición de ITS/ITS2 y/o trnH-psbA según el grupo taxonómico y los objetivos de la investigación (Hollingsworth et al., 2011; China Plant BOL Group, 2011).

2.4. Hongos: ITS como marcador universal

Para los hongos, la búsqueda de un código de barras estándar tampoco fue sencilla. El COI mitocondrial resultó inadecuado: en los hongos a menudo contiene grandes intrones, se amplifica mal y es insuficientemente variable (Schoch et al., 2012). Como resultado, el consorcio internacional Fungal Barcoding Consortium realizó una comparación a gran escala de varios marcadores: ITS, LSU, SSU y RPB1.

Sobre la base del análisis de 742 cepas que representan 17 linajes principales de hongos, se estableció que ITS (internal transcribed spacer) posee la mejor combinación de universalidad, calidad de secuencia y capacidad de resolución (Schoch et al., 2012). ITS mostró una probabilidad de identificación correcta de 0,73, comparable con el código de barras de dos loci para plantas (0,70). Es importante que ITS se amplifica con éxito en la mayoría de los hongos con cebadores universales, aunque para algunos grupos (por ejemplo, Glomeromycota) pueden requerirse esfuerzos adicionales.

Los marcadores proteicos como RPB1 (subunidad mayor de la ARN polimerasa II), RPB2 y MCM7 mostraron una resolución más alta, pero su amplificación es menos fiable y no universal (Schoch et al., 2012). Por ello, ITS fue recomendado oficialmente como código de barras principal para hongos, con la posibilidad de utilizar marcadores adicionales para grupos particulares.

2.5. Bacterias: ARNr 16S y sus limitaciones

Para bacterias y arqueas, el marcador estándar es el gen ARNr 16S (subunidad ribosomal pequeña). Esta elección se debe a varias razones: el gen está presente en todas las bacterias, contiene regiones conservadas para cebadores universales y regiones variables para distinguir taxones (Janda and Abbott, 2007).

Sin embargo, el ARNr 16S tiene limitaciones significativas a nivel de especie. Con frecuencia se utiliza un umbral de similitud del 97% para definir una especie, pero no es universal: algunas especies pueden tener más del 97% de similitud y estar reproductivamente aisladas, mientras que otras pueden tener menos del 97% y pertenecer a la misma especie (Stackebrandt and Goebel, 1994). Janda and Abbott (2007) señalan que el ARNr 16S proporciona una identificación fiable hasta género en >90% de los casos, pero hasta especie solo en el 65–83%.

Para aumentar la resolución a nivel de especie se utilizan marcadores adicionales como rpoB, gyrB, recA y otros genes housekeeping. En algunos casos se emplea la secuenciación del genoma completo o MLST (multi-locus sequence typing). No obstante, el ARNr 16S sigue siendo la herramienta principal para la identificación rápida y los estudios filogenéticos de bacterias.

2.6. Oomicetos: ITS, COX1 y COX2

Los oomicetos son un grupo de organismos filogenéticamente alejados de los hongos verdaderos, pero a menudo estudiados junto con ellos debido a su estilo de vida y morfología similares. Muchos oomicetos son patógenos peligrosos de plantas (por ejemplo, Phytophthora infestans, el agente causal del tizón tardío de la patata). Para su identificación se han propuesto diversos marcadores.

ITS (internal transcribed spacer) es históricamente el primer marcador y el más ampliamente utilizado para oomicetos. Sin embargo, en algunos géneros (por ejemplo, Phytophthora) ITS puede ser insuficientemente variable para distinguir especies cercanas, mientras que en otros (por ejemplo, Plasmopara) puede contener inserciones largas que dificultan la amplificación (Robideau et al., 2011).

COI (citocromo c oxidasa subunidad I) es un marcador mitocondrial que se propuso como complemento a ITS. Robideau et al. (2011) demostraron que COI proporciona una buena resolución para muchos oomicetos y puede ser más eficaz que ITS para algunos grupos. Por ejemplo, COI distingue Phytophthora infestans, P. mirabilis y P. andina, que tienen secuencias ITS idénticas.

COX2 (citocromo c oxidasa subunidad II) es otro marcador mitocondrial ampliamente utilizado para estudios filogenéticos de oomicetos. Choi et al. (2015) compararon cox1 y cox2 para 31 géneros de oomicetos y concluyeron que cox2 posee mejor amplificabilidad, mayor divergencia nucleotídica y mejor capacidad de resolución a nivel de especie. Recomendaron cox2 como código de barras principal para oomicetos, con la posibilidad de utilizar ITS como complemento.

Así, para los oomicetos actualmente se recomienda una combinación de ITS y COX2 (o COX1) para una identificación fiable.

2.7. Nematodos: SSU, ITS y COI

Los nematodos son uno de los grupos más difíciles para la identificación morfológica. Su pequeño tamaño, el conjunto limitado de caracteres diagnósticos y la alta variabilidad críptica hacen que los métodos moleculares sean especialmente demandados (Floyd et al., 2002; Powers, 2004).

Floyd et al. (2002) propusieron utilizar SSU (subunidad pequeña, ARNr 18S) para crear MOTU (Molecular Operational Taxonomic Units) en nematodos del suelo. Demostraron que las secuencias de SSU de aproximadamente 450 pares de bases permiten distinguir especies con un umbral de similitud >99,5%. Este enfoque funciona bien para evaluar la diversidad, pero no siempre proporciona identificación específica debido a la ausencia de bases de referencia completas.

ITS (internal transcribed spacer) es un marcador más variable que se utiliza ampliamente para el diagnóstico de nematodos, especialmente en los géneros Meloidogyne, Heterodera y Globodera. Por ejemplo, ITS permite distinguir M. chitwoodi y M. fallax, que son morfológicamente indistinguibles (Powers, 2004).

COI es un marcador mitocondrial que también se emplea para la identificación de nematodos. Sin embargo, en algunos grupos (por ejemplo, Meloidogyne) el genoma mitocondrial tiene una estructura inusual, lo que limita el uso de COI (Powers, 2004). No obstante, para muchos nematodos COI proporciona una buena resolución y se utiliza en combinación con ITS.

2.8. Criterios de selección de marcadores: regiones conservadas vs variables

La elección del marcador para el DNA barcoding es siempre un compromiso entre varios criterios (Hollingsworth et al., 2011; Schoch et al., 2012):

1. Universalidad de los cebadores. El marcador debe amplificarse en la gama más amplia posible de taxones con cebadores estándar. Esto es especialmente importante para el metabarcoding y el análisis de muestras mixtas.

2. Variabilidad. La región debe poseer suficiente variabilidad para distinguir especies cercanamente relacionadas. Sin embargo, una variabilidad demasiado alta puede conducir a polimorfismo intraespecífico y dificultar la identificación.

3. Calidad de las secuencias. El marcador debe ser fácil de secuenciar, sin repeticiones mononucleotídicas largas, intrones y otras estructuras que dificulten el alineamiento y el análisis.

4. Longitud. La longitud óptima es de 400–800 pares de bases. Las secuencias demasiado cortas no proporcionan suficiente resolución; las demasiado largas son difíciles para la secuenciación rutinaria.

5. Disponibilidad de una base de referencia. Incluso un marcador ideal es inútil si no existe una base de datos de referencia para él. BOLD y GenBank contienen millones de secuencias, pero su cobertura es desigual entre taxones.

6. Inequívoca. El marcador debe proporcionar una identificación inequívoca, es decir, la variabilidad intraespecífica debe ser menor que la interespecífica (barcode gap).

En la tabla 2.1 se presentan los principales marcadores para diferentes grupos de organismos.

Tabla 2.1. Marcadores estándar de DNA barcoding para diferentes grupos de organismos

3.1. Introducción: de la muestra a la secuencia

El DNA barcoding es un proceso de múltiples etapas que comienza con la recolección de material biológico y termina con la comparación de la secuencia obtenida con una base de datos de referencia. Cada etapa tiene sus particularidades metodológicas, limitaciones y fuentes de error. La comprensión del workflow completo es necesaria para la evaluación crítica de los resultados y la interpretación correcta de los datos (Hajibabaei et al., 2007; Collins and Cruickshank, 2013).

En general, el proceso de DNA barcoding incluye las siguientes etapas:

1. Recolección y conservación de la muestra

2. Extracción de ADN

3. Amplificación de la región diana mediante PCR

4. Secuenciación del amplicón

5. Análisis de la secuencia y comparación con una base de datos de referencia

6. Interpretación de los resultados y asignación del nombre taxonómico

Cada una de estas etapas puede automatizarse en diversa medida, y los desarrollos tecnológicos modernos permiten realizar parte de las operaciones en condiciones de campo (Jain et al., 2016). Consideremos cada etapa en detalle.

3.2. Recolección y conservación de la muestra

La primera etapa —la recolección de material biológico— parece trivial, pero es precisamente aquí donde a menudo se sientan las bases de problemas futuros. Para el DNA barcoding puede utilizarse material muy diverso: fragmentos de tejidos, organismos pequeños completos, muestras de herbario, ejemplares de museo, contenido estomacal, heces, suelo, agua e incluso aire (Deiner et al., 2017; Staats et al., 2016).

El requisito clave para la muestra es la preservación del ADN. La degradación del ADN comienza inmediatamente después de la muerte del organismo o de la separación del tejido. Las enzimas (nucleasas), los microorganismos y los factores físicos (temperatura, humedad, radiación UV) destruyen la molécula de ADN. Por ello, la conservación adecuada de la muestra es crítica para el éxito del barcoding (Staats et al., 2016).

Métodos principales de conservación:

• Congelación. El almacenamiento a −20 °C o −80 °C es el método óptimo para la mayoría de los tejidos. Sin embargo, requiere equipamiento y no siempre está disponible en el campo.
• Etanol (95–100%). Se utiliza ampliamente para conservar animales, especialmente insectos y nematodos. El etanol fija los tejidos y previene el crecimiento microbiano, pero con el tiempo puede provocar la degradación del ADN.
• Gel de sílice. Se utiliza para el secado rápido de tejidos vegetales (hojas, raíces). El gel de sílice absorbe la humedad y crea condiciones que impiden la descomposición del ADN (Kress and Erickson, 2007).
• Tampones de lisis. Soluciones especiales (por ejemplo, CTAB) permiten conservar el ADN a temperatura ambiente durante mucho tiempo.
• Tarjetas FTA. Papel impregnado con reactivos que lisan las células e inmovilizan el ADN. Conveniente para investigaciones de campo (Staats et al., 2016).

Casos especiales:

• Muestras de herbario. El ADN en las muestras de herbario a menudo está fragmentado, pero con un manejo cuidadoso puede utilizarse para el barcoding. Es importante evitar la contaminación y utilizar mini-códigos de barras (Staats et al., 2016).
• Ejemplares de museo. El ADN en colecciones antiguas puede estar muy degradado. Para un análisis exitoso se requieren métodos especiales de extracción y amplificación de fragmentos cortos (Hajibabaei et al., 2007).
• Productos procesados. En productos alimenticios, medicamentos y medicinas tradicionales, el ADN puede estar fragmentado y mezclado con otros organismos. Para el análisis de tales muestras se utilizan mini-códigos de barras y metabarcoding (Staats et al., 2016; Galimberti et al., 2013).

El problema de la contaminación. La contaminación de la muestra con ADN extraño es uno de los principales problemas del barcoding. Las fuentes de contaminación incluyen: reactivos, equipamiento, manos del investigador, otros organismos en la muestra. Para minimizar el riesgo se utilizan controles negativos, materiales desechables y una esterilización minuciosa (Collins and Cruickshank, 2013).

3.3. Extracción de ADN

Después de la recolección de la muestra, es necesario extraer el ADN: liberarlo de componentes celulares, proteínas, lípidos y otras impurezas que pueden inhibir la PCR. Los métodos de extracción varían según el tipo de tejido y el estado de la muestra.

Enfoques principales:

• Extracción con fenol-cloroformo. Método clásico basado en la separación de fases. Las proteínas y los lípidos pasan a la fase orgánica, el ADN permanece en la fase acuosa. El método es eficaz pero laborioso y requiere trabajar con reactivos tóxicos.
• Sorción en sílice. El ADN se une a la sílice en presencia de sales caotrópicas, luego se lava y se eluye. Este principio subyace en la mayoría de los kits comerciales de extracción de ADN. El método es rápido y conveniente para la automatización (Ivanova et al., 2006).
• Método CTAB. Se utiliza ampliamente para plantas que contienen polisacáridos y polifenoles que inhiben la PCR. El CTAB precipita los polisacáridos, dejando el ADN en solución (Kress and Erickson, 2007).
• Partículas magnéticas. El ADN se une a nanopartículas magnéticas recubiertas de sílice u otros grupos de afinidad. El método se automatiza fácilmente y se utiliza en sistemas de alto rendimiento.

Problemas de la extracción:

• Inhibidores de la PCR. Polisacáridos, polifenoles, ácidos húmicos, hemo y otros compuestos pueden inhibir la polimerasa. Para eliminarlos se utilizan etapas adicionales de purificación (por ejemplo, PVPP, BSA).
• Degradación del ADN. Al trabajar con muestras dañadas, el ADN puede estar fragmentado. En tales casos se utilizan mini-códigos de barras (Staats et al., 2016).
• Bajo contenido de ADN. Algunas muestras (por ejemplo, células individuales, ejemplares de museo antiguos) contienen cantidades mínimas de ADN. Para el análisis se requieren métodos especiales de amplificación (whole genome amplification) o sistemas de detección sensibles.

Control de calidad. Después de la extracción de ADN se evalúa su concentración y pureza mediante espectrofotometría (NanoDrop) o fluorimetría (Qubit). La relación A260/A280 indica la pureza respecto a proteínas; A260/A230 indica la pureza respecto a sales y compuestos orgánicos.

3.4. Amplificación de la región diana mediante PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la etapa central del DNA barcoding. Es en esta etapa donde se amplifica la región diana del código de barras utilizando cebadores específicos (Hebert et al., 2003; Hajibabaei et al., 2007).

Cebadores universales. La idea clave del DNA barcoding es el uso de cebadores que funcionan en una amplia gama de organismos. Para el COI de animales, la pareja clásica es LCO1490 y HCO2198, que amplifican un fragmento de aproximadamente 658 pares de bases (Folmer et al., 1994). Para las plantas se utilizan cebadores para rbcL, matK, ITS y trnH-psbA (CBOL Plant Working Group, 2009; China Plant BOL Group, 2011). Para los hongos, cebadores para ITS (Schoch et al., 2012). Para los oomicetos, cebadores para ITS, COX1 y COX2 (Robideau et al., 2011; Choi et al., 2015).

El problema de la universalidad. No existen cebadores que funcionen en todos los organismos sin excepción. Incluso para COI en algunos grupos (por ejemplo, cnidarios, nematodos), los cebadores estándar pueden no funcionar. En tales casos se utilizan cebadores alternativos, cebadores degenerados (mezclas de oligonucleótidos con diferentes bases en posiciones variables) o cócteles de varios cebadores (Ivanova et al., 2006; Cywinska et al., 2006).

Etapas de la PCR:

1. Desnaturalización. El ADN de doble cadena se separa en moléculas de cadena simple al calentarse a 94–98 °C.

2. Hibridación de cebadores. Los cebadores se unen a las regiones complementarias de la matriz a 45–65 °C (depende de los cebadores).

3. Elongación. La polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del cebador a 72 °C.

4. Repetición. El ciclo se repite 30–40 veces, lo que conduce a una acumulación exponencial del fragmento diana.

Optimización de la PCR. Para una amplificación exitosa es necesario optimizar:

• Concentración de MgCl₂ (cofactor de la polimerasa)
• Concentración de cebadores
• Temperatura de hibridación
• Número de ciclos
• Composición del tampón

Problemas de la PCR:

• Amplificación inespecífica. Pueden amplificarse fragmentos no diana, lo que contamina la secuencia.
• Ausencia de amplificación. Puede estar relacionada con mutaciones en el sitio de unión del cebador, inhibidores de la PCR o degradación del ADN.
• Contaminación. La contaminación con ADN extraño puede conducir a resultados falsos positivos.
• Heteroplasmia y NUMTs. En los animales, los genes mitocondriales pueden existir como copias nucleares (NUMTs: pseudogenes mitocondriales nucleares), que se amplifican junto con los mitocondriales y distorsionan los resultados (Hebert et al., 2004).

Mini-códigos de barras. Para el ADN degradado se utilizan fragmentos acortados (100–300 pares de bases), que se amplifican con mayor facilidad. Sin embargo, los mini-códigos de barras pueden poseer menor capacidad de resolución (Staats et al., 2016; Meusnier et al., 2008).

PCR multiplex. Para el análisis de muestras mixtas (metabarcoding) se utiliza la PCR multiplex, que permite amplificar varios marcadores simultáneamente (Deiner et al., 2017).

3.5. Secuenciación del amplicón

Después de una amplificación exitosa, es necesario determinar la secuencia de nucleótidos del fragmento obtenido. Para el DNA barcoding pueden utilizarse varios métodos de secuenciación.

Método de Sanger. Método de secuenciación clásico desarrollado por Frederick Sanger en 1977. Se basa en la terminación de la síntesis de ADN mediante dideoxinucleótidos. El método de Sanger sigue siendo el «patrón de oro» para el DNA barcoding debido a su alta precisión y longitud de lectura (hasta 1000 pares de bases). Sin embargo, es relativamente caro y de bajo rendimiento, lo que limita su uso para grandes muestras (Hajibabaei et al., 2007).

Secuenciación de alto rendimiento (NGS). Las tecnologías de segunda y tercera generación permiten secuenciar millones de secuencias simultáneamente. Plataformas principales:

• Illumina (MiSeq, HiSeq, NextSeq). Lecturas cortas (150–300 pares de bases), alta precisión, bajo coste por base. Se utilizan ampliamente para metabarcoding (Deiner et al., 2017).
• Ion Torrent. Secuenciación semiconductora, longitud de lectura media (200–400 pares de bases), ejecuciones rápidas.
• PacBio (SMRT). Lecturas largas (hasta 20 kbp), alta tasa de error (10–15%), pero los errores son aleatorios y pueden corregirse.
• Oxford Nanopore (MinION). Secuenciadores portátiles, lecturas largas (hasta 100+ kbp), funcionan en tiempo real. MinION es especialmente prometedor para investigaciones de campo (Jain et al., 2016).

La elección del método de secuenciación depende de los objetivos de la investigación. Para el barcoding rutinario de muestras individuales se utiliza a menudo Sanger. Para metabarcoding y grandes muestras, NGS. Para investigaciones de campo, secuenciadores portátiles como MinION (Jain et al., 2016).

Control de calidad de las secuencias. Después de la secuenciación es necesario evaluar la calidad de los datos:

• Phred score. Evaluación de la probabilidad de error en cada posición. Alta calidad: Phred >30 (probabilidad de error <0,1%).
• Cromatogramas. Análisis visual de los picos para identificar bases ambiguas.
• Longitud de la secuencia. Para el código de barras estándar COI: aproximadamente 658 pares de bases; para mini-códigos de barras: 100–300.
• Presencia de codones de parada. Para genes codificantes de proteínas (COI, rbcL, matK), la presencia de codones de parada puede indicar NUMTs o errores de secuenciación.

3.6. Comparación con una base de datos de referencia

Después de obtener una secuencia de alta calidad, es necesario compararla con una base de datos de referencia para determinar la pertenencia específica de la muestra. Existen varias bases de datos principales utilizadas en el DNA barcoding.

BOLD (Barcode of Life Data System). La plataforma central para el DNA barcoding, desarrollada en la Universidad de Guelph (Canadá) (Ratnasingham and Hebert, 2007). BOLD contiene:

• Millones de secuencias de códigos de barras
• Metadatos sobre vouchers (identificación morfológica, lugar de recolección, colección)
• Imágenes de las muestras
• Herramientas de análisis (Identification Engine, Taxon ID Tree, sistema BIN)

BOLD utiliza el sistema BIN (Barcode Index Number): agrupaciones de secuencias que corresponden a especies con un alto grado de concordancia. BIN permite identificar muestras incluso en ausencia de una coincidencia exacta con una secuencia de referencia (Ratnasingham and Hebert, 2013).

GenBank. La mayor base de datos pública de secuencias de nucleótidos, mantenida por NCBI (EE. UU.). GenBank contiene millones de secuencias, incluidas las de códigos de barras. Sin embargo, la calidad de los datos en GenBank varía: muchas secuencias no están vinculadas a vouchers, pueden contener errores de identificación o ser resultado de contaminación (Janda and Abbott, 2007). Por ello, para el DNA barcoding es preferible utilizar BOLD o bases de datos cuidadosamente curadas.

Otras bases de datos:

• UNITE — para hongos (ITS)
• SILVA — para genes ribosomales
• PR2 — para protistas
• MMDBD — para plantas medicinales

Algoritmos de comparación:

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). El método de comparación más popular. BLAST encuentra alineamientos locales entre la consulta y la base de datos, calcula una puntuación de similitud y un E-value. El resultado es una lista de las secuencias más similares (Altschul et al., 1990). Limitación de BLAST: no tiene en cuenta la longitud de la secuencia al evaluar la similitud, lo que puede conducir a resultados falsos.

Neighbour-Joining (NJ). Método filogenético utilizado para visualizar los resultados del barcoding. Las secuencias se agrupan en un árbol, y la muestra se asigna al grupo con el que se agrupa. Los árboles NJ son sencillos de interpretar, pero pueden dar resultados erróneos con una base de referencia incompleta (Collins and Cruickshank, 2013).

ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery). Método de determinación automática de la brecha del código de barras y división de secuencias en especies hipotéticas. ABGD no requiere análisis filogenético y funciona rápidamente incluso con grandes muestras (Puillandre et al., 2012).

Best Match / Best Close Match. Métodos alternativos de identificación basados en distancias genéticas. Best Match asigna a la muestra la especie de la secuencia de referencia más cercana. Best Close Match tiene en cuenta un umbral de similitud y puede dar un resultado de «no match» en ausencia de secuencias cercanas (Meier et al., 2006).

3.7. Umbrales de similitud y el problema del «barcode gap»

Una cuestión clave en la interpretación de los resultados del barcoding es qué nivel de similitud se considera suficiente para la identificación de especies. Tradicionalmente se utiliza un umbral del 97–98% (Hebert et al., 2003), pero este umbral no es universal.

Barcode gap. El concepto de brecha del código de barras supone que la divergencia genética interespecífica supera la intraespecífica. Si esto es así, existe un umbral por encima del cual las secuencias pertenecen a una misma especie y por debajo del cual pertenecen a especies diferentes. Sin embargo, Meyer and Paulay (2005) demostraron que en los moluscos la variabilidad intraespecífica puede solaparse con la interespecífica, lo que hace que el enfoque de umbral sea poco fiable.

Problemas de los umbrales:

• Solapamiento de distribuciones. La variabilidad intraespecífica puede ser mayor que la interespecífica para algunos pares de especies.
• Diferencias entre taxones. El umbral óptimo varía entre grupos. Por ejemplo, para nematodos el umbral puede ser del 99,5% (Floyd et al., 2002), para aves del 98% (Hebert et al., 2004).
• Especies jóvenes. Las especies que divergieron recientemente pueden tener una baja divergencia interespecífica.
• Hibridación. Con la introgresión del ADN mitocondrial, las especies pueden tener secuencias idénticas o similares (Meyer and Paulay, 2005).

Alternativas a los umbrales:

• Sistema BIN de BOLD. Agrupación de secuencias basada en distancias genéticas en lugar de un umbral fijo (Ratnasingham and Hebert, 2013).
• ABGD. Determinación automática de la brecha del código de barras para cada muestra concreta (Puillandre et al., 2012).
• Métodos estadísticos. Delimitación bayesiana, GMYC (General Mixed Yule Coalescent) y otros (Puillandre et al., 2012).

Recomendaciones prácticas. Collins and Cruickshank (2013) recomiendan:

• No utilizar umbrales fijos sin verificación
• Utilizar Best Close Match en lugar de un simple umbral
• Tener en cuenta la incompletitud de la base de referencia
• Verificar los resultados con datos independientes (morfología, ecología)

3.8. Automatización y miniaturización

Los desarrollos tecnológicos modernos están dirigidos a la automatización y miniaturización de todas las etapas del DNA barcoding, lo que es especialmente importante para la investigación de campo y el cribado de alto rendimiento.

Automatización de laboratorio. Los sistemas robóticos para la extracción de ADN, la preparación de PCR y la secuenciación permiten procesar miles de muestras al día con una participación humana mínima. Un ejemplo es el Canadian Centre for DNA Barcoding (CCDB), que procesa más de 100.000 muestras al año (Ivanova et al., 2006).

Chips microfluídicos. Los dispositivos lab-on-a-chip permiten realizar la extracción de ADN, la PCR e incluso la secuenciación en formato miniaturizado. Esto reduce el consumo de reactivos y el tiempo de análisis (Deiner et al., 2017).

Secuenciadores portátiles. El Oxford Nanopore MinION es un secuenciador portátil del tamaño de una memoria USB que funciona en tiempo real. MinION puede utilizarse en condiciones de campo, incluidas expediciones remotas e incluso la Estación Espacial Internacional (Jain et al., 2016).

Laboratorios de campo. Se están desarrollando kits portátiles de DNA barcoding que incluyen todo lo necesario para la extracción de ADN, la PCR y la secuenciación. Esto abre posibilidades para el diagnóstico rápido en lugares donde no hay acceso a laboratorios estacionarios (Jain et al., 2016).

Diagnóstico CRISPR. La tecnología CRISPR-Cas puede utilizarse para la detección de secuencias específicas de ADN sin secuenciación. Esta es una dirección prometedora para el diagnóstico rápido de campo (Jain et al., 2016).

4.1. Introducción: los límites de aplicabilidad del método

El DNA barcoding ha demostrado una alta eficacia para la identificación de especies en los más diversos grupos de organismos. Sin embargo, como cualquier método, tiene límites de aplicabilidad. En este capítulo examinaremos situaciones en las que el barcoding falla, conduce a conclusiones erróneas o simplemente no funciona. La comprensión de estas limitaciones es crítica para la interpretación correcta de los resultados y para la elección de métodos de diagnóstico adecuados (Meyer and Paulay, 2005; Collins and Cruickshank, 2013; Taylor and Harris, 2012).

El problema clave radica en que el DNA barcoding se basa en varios supuestos que no siempre se cumplen:

1. La divergencia genética interespecífica supera la intraespecífica (existe una «barcode gap»)

2. El marcador elegido evoluciona a una velocidad constante en diferentes linajes

3. La base de datos de referencia contiene secuencias para todas las especies posibles

4. Las especies morfológicas utilizadas para crear la base de referencia corresponden a especies biológicas

Cuando estos supuestos se violan, el barcoding puede dar resultados falsos positivos, falsos negativos o ambiguos. Consideremos las principales situaciones problemáticas.

4.2. Especies cercanamente relacionadas y complejos crípticos

Uno de los problemas más frecuentes es la presencia de especies cercanamente relacionadas que tienen una baja divergencia interespecífica para el marcador del código de barras. Este problema es especialmente agudo para las especies crípticas: taxones morfológicamente indistinguibles pero genéticamente diferentes (Bickford et al., 2007).

Las especies crípticas están ampliamente distribuidas en todos los grupos de organismos. Bickford et al. (2007) señalan que se han encontrado complejos crípticos en moluscos de aguas profundas, peces de agua dulce, mariposas tropicales, plantas árticas, hongos, nematodos y muchos otros grupos. Las causas de la cripticidad son diversas: señales de apareamiento no visuales (feromonas, señales acústicas), estasis morfológica bajo selección estabilizadora, divergencia reciente (Bickford et al., 2007).

Para el DNA barcoding, las especies crípticas representan una dificultad particular. Si dos especies divergieron recientemente, sus secuencias de código de barras pueden ser idénticas o diferir en 1–2 nucleótidos. Con un umbral de similitud estándar del 97–98%, tales especies serán indistinguibles (Meyer and Paulay, 2005). Además, si una de las especies no está representada en la base de datos de referencia, la muestra puede ser asignada erróneamente a otra especie.

Ejemplos de complejos crípticos:

• Mosquitos. Cywinska et al. (2006) descubrieron que Aedes fitchii y Aedes grossbecki tienen una baja divergencia interespecífica en COI y signos morfológicos de hibridación. La divergencia intraespecífica en Ae. fitchii alcanzaba el 3,6–3,9%, solapándose con las diferencias interespecíficas.
• Nematodos. Floyd et al. (2002) demostraron que algunas especies de nematodos morfológicamente distintas tienen secuencias SSU idénticas. Por ejemplo, Cephalobus y Acrobeloides, dos géneros que son morfológicamente difíciles de distinguir y tienen secuencias SSU cercanas.
• Hongos. Schoch et al. (2012) señalan que las secuencias ITS son idénticas en varios complejos de especies de Aspergillus, Penicillium y Fusarium, que son económicamente importantes y médicamente significativos.

El problema de la divergencia reciente. Puillandre et al. (2012), en experimentos de simulación, demostraron que ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery) no funciona cuando la tasa de especiación es comparable a la tasa de deriva genética. En este caso, la divergencia interespecífica e intraespecífica se solapan y la brecha del código de barras desaparece. Esto es especialmente característico de grupos con radiación reciente o con grandes tamaños efectivos de población.

Consecuencias prácticas. Para grupos con especies crípticas, el DNA barcoding debe utilizarse con precaución. Se recomienda:

• Utilizar varios marcadores independientes (enfoque multi-locus)
• Aplicar métodos estadísticos de delimitación de especies (ABGD, GMYC, delimitación bayesiana)
• Combinar datos moleculares con datos ecológicos, conductuales y geográficos

4.3. Hibridación e introgresión

La hibridación —el cruzamiento entre especies— y la introgresión —la penetración de genes de una especie en el acervo genético de otra— crean serios problemas para el DNA barcoding. Durante la hibridación, el ADN mitocondrial (o el ADN plastídico en las plantas) de una especie puede penetrar en el acervo genético de otra, lo que conduce a una falta de correspondencia entre la morfología y la secuencia del código de barras (Meyer and Paulay, 2005; China Plant BOL Group, 2011).

Mecanismos:

• Introgresión del ADN mitocondrial. En los animales, el ADN mitocondrial se hereda por vía materna. Durante la hibridación, la descendencia recibe las mitocondrias de la madre. Si el híbrido se cruza con un representante de la especie paterna, el ADN mitocondrial de la especie materna puede fijarse en la población de la especie paterna. Como resultado, individuos morfológicamente pertenecientes a la especie A pueden tener ADN mitocondrial de la especie B (Meyer and Paulay, 2005).
• Captura de cloroplastos en plantas. En las plantas, el ADN plastídico también se hereda por vía materna (en la mayoría de las angiospermas). Durante la hibridación y la introgresión, el genoma plastídico de una especie puede reemplazar al de otra. Este fenómeno, conocido como «chloroplast capture», está ampliamente extendido en las plantas (China Plant BOL Group, 2011; Hollingsworth et al., 2011).

Ejemplos:

• Plantas. China Plant BOL Group (2011) descubrió que en el 45,2% de los géneros con varias especies existe una falta de correspondencia entre ITS y los códigos de barras plastídicos. Esto se explica por hibridación, introgresión o clasificación incompleta de linajes. Por ejemplo, en Quercus, Salix, Pinus y otros géneros, los haplotipos plastídicos a menudo no corresponden a los límites específicos (Hollingsworth et al., 2011).
• Animales. Cywinska et al. (2006) describieron una posible hibridación entre Aedes fitchii y Ae. grossbecki: los individuos de Ae. fitchii tenían caracteres morfológicos de ambas especies. Hebert et al. (2004) señalaron que en las mariposas Astraptes fulgerator, algunos individuos tenían secuencias COI heterocigotas, lo que indica una posible hibridación o amplificación de NUMTs.
• Peces. En algunas especies de peces se observa introgresión del ADN mitocondrial, lo que conduce a una falta de correspondencia entre la morfología y el código de barras (Taylor and Harris, 2012).

Problema para el barcoding. Durante la hibridación y la introgresión, la secuencia del código de barras puede no corresponder a la pertenencia específica del individuo determinada por la morfología. Esto conduce a:

• Identificaciones falsas
• Evaluación incorrecta de la biodiversidad
• Conclusiones erróneas sobre la distribución de las especies

Soluciones. Para grupos con hibridación frecuente se recomienda:

• Utilizar marcadores nucleares (ITS, RPB1, RPB2) además de los mitocondriales o plastídicos
• Analizar varios loci independientes
• Tener en cuenta los datos biogeográficos y ecológicos

4.4. Poliploidía

La poliploidía —el aumento del número de cromosomas— está ampliamente extendida en plantas, hongos y algunos animales. Las especies poliploides pueden tener genomas complejos con varias copias de genes, lo que crea problemas para el DNA barcoding (Hollingsworth et al., 2011).

Problemas:

• Múltiples copias de ITS. En las plantas poliploides, ITS puede existir en varias variantes, que pueden ser resultado de hibridación o de una evolución concertada incompleta. Esto conduce a polimorfismo de secuencias y dificulta la determinación de la especie (China Plant BOL Group, 2011).
• Herencia uniparental de los plastos. En los poliploides, el genoma plastídico se hereda de uno de los progenitores, lo que puede no reflejar la composición genómica completa. Como resultado, el código de barras plastídico puede no corresponder a la especie determinada por la morfología (Hollingsworth et al., 2011).
• Alopoliploides. En la alopoliploidía (poliploidía híbrida), las diferentes especies parentales pueden tener diferentes secuencias de código de barras. Si un alopoliploide heredó el genoma plastídico de uno de los progenitores, se agrupará con ese progenitor y no con el otro (Hollingsworth et al., 2011).

Ejemplos:

• Helechos. Muchos helechos son poliploides. Grusz et al. (2009) demostraron que Cheilanthes yavapensis es un tetraploide apomíctico originado por hibridación de C. fendleri y C. lindheimeri. El código de barras plastídico no permite identificar inequívocamente tales híbridos.
• Plantas con flores. En Taraxacum, Hieracium, Rubus y otros géneros con apomixis y poliploidía, el barcoding a menudo no funciona debido a la compleja estructura genómica (Hollingsworth et al., 2011).

Soluciones. Para grupos poliploides se recomienda:

• Utilizar marcadores nucleares con múltiples copias (ITS, ETS)
• Analizar varios loci independientes
• Aplicar clonación para separar las variantes de ITS
• Utilizar datos morfológicos y citológicos

4.5. Variabilidad intraespecífica

La alta variabilidad genética intraespecífica es uno de los principales problemas del DNA barcoding. Si la divergencia intraespecífica supera la interespecífica, la brecha del código de barras desaparece y la identificación se vuelve poco fiable (Meyer and Paulay, 2005).

Causas de la variabilidad intraespecífica:

• Estructura geográfica. Las poblaciones de una misma especie pueden estar genéticamente diferenciadas debido a un flujo génico limitado. Meyer and Paulay (2005) demostraron que en los gasterópodos marinos la divergencia intraespecífica puede alcanzar el 3–4%, solapándose con las diferencias interespecíficas.
• Procesos históricos. Las estructuras poblacionales antiguas, el contacto secundario y la clasificación incompleta de linajes crean una alta variabilidad intraespecífica.
• Heteroplasmia. La presencia de varias variantes de ADN mitocondrial en una célula u organismo. En insectos, nematodos y otros grupos, la heteroplasmia puede alcanzar el 1–2% (Hebert et al., 2004).
• NUMTs. Las copias nucleares de genes mitocondriales (pseudogenes mitocondriales nucleares) pueden amplificarse junto con los mitocondriales, creando un falso polimorfismo. Hebert et al. (2004) descubrieron que el 2,8% de las secuencias COI en Astraptes fulgerator eran NUMTs.

Problema para el barcoding. La alta variabilidad intraespecífica conduce a:

• Resultados falsos negativos (la muestra no coincide con la secuencia de referencia de su especie)
• Resultados falsos positivos (la muestra coincide con la secuencia de referencia de otra especie)
• Identificaciones ambiguas

Ejemplos:

• Moluscos. Meyer and Paulay (2005) demostraron que en los moluscos la divergencia intraespecífica en COI puede alcanzar el 3–4%, mientras que la interespecífica oscila entre el 0–18%. El umbral óptimo para minimizar los errores fue del 2,6%, pero incluso entonces el error alcanzaba el 17%.
• Nematodos. Floyd et al. (2002) descubrieron que la variabilidad intraespecífica de SSU en nematodos puede alcanzar el 0,5%, lo que requiere un umbral del 99,5% para distinguir especies.
• Hongos. Schoch et al. (2012) señalaron que en Glomeromycota la variabilidad intraespecífica de ITS puede alcanzar el 20%, lo que hace que el barcoding sea prácticamente inútil para este grupo.

Soluciones. Para grupos con alta variabilidad intraespecífica se recomienda:

• Aumentar el umbral de similitud (por ejemplo, hasta el 99% para nematodos)
• Utilizar varios marcadores
• Analizar varias muestras por especie
• Aplicar métodos estadísticos (ABGD, GMYC)

4.6. Ausencia de secuencias de referencia

El DNA barcoding funciona solo cuando se dispone de una base de datos de referencia en la que las secuencias están vinculadas a vouchers identificados morfológicamente. Si una especie está ausente de la base de datos, la identificación es imposible (Ratnasingham and Hebert, 2007; Collins and Cruickshank, 2013).

Problemas:

• Incompletitud de las bases de datos. BOLD contiene millones de secuencias, pero la cobertura es desigual. Para muchos grupos (especialmente invertebrados tropicales, hongos, protistas), los datos de referencia están ausentes o son fragmentarios (Taylor and Harris, 2012).
• Sesgo geográfico. La mayoría de los datos de códigos de barras se han obtenido para América del Norte y Europa. Las regiones tropicales, donde la biodiversidad es más alta, están poco representadas (Usman et al., 2025).
• Sesgo taxonómico. Algunos grupos (aves, peces, mariposas) están bien estudiados; otros (nematodos, hongos, protistas) están poco estudiados. Taylor and Harris (2012) señalaron que el 53% de los estudios de barcoding se dedican a invertebrados, el 16% a plantas, el 11% a peces, pero solo el 4% a hongos y el 5% a protistas.
• Errores de identificación. Incluso las bases de datos curadas pueden contener errores. Nilsson et al. (2006) demostraron que hasta el 20% de las secuencias ITS en GenBank pueden estar mal identificadas.

Consecuencias. La ausencia de secuencias de referencia conduce a:

• Imposibilidad de identificación de la muestra
• Identificaciones falsas (la muestra se asigna a la especie más cercana en la base de datos, incluso si esto es incorrecto)
• Evaluación incorrecta de la biodiversidad

Ejemplos:

• Nematodos. Floyd et al. (2002) señalaron que solo una pequeña parte de las especies de nematodos descritas tienen secuencias SSU en GenBank. Para la mayoría de las especies, los datos de referencia están ausentes.
• Hongos. Schoch et al. (2012) demostraron que, a pesar de la presencia de 172.000 secuencias ITS en GenBank, solo el 56% de ellas están vinculadas a nombres latinos. Muchas especies de hongos no están representadas en las bases de datos.
• Oomicetos. Robideau et al. (2011) señalaron que para muchos géneros de oomicetos (por ejemplo, Plasmopara, Bremia), las secuencias ITS de referencia están ausentes o son fragmentarias.

Soluciones. Para superar este problema es necesario:

• Ampliar las bases de datos de referencia, especialmente para grupos y regiones poco estudiados
• Garantizar la vinculación de las secuencias a los vouchers
• Verificar la calidad de los datos en las bases de datos públicas
• Utilizar métodos de identificación «proximales» (por ejemplo, el sistema BIN de BOLD)

4.7. Contaminación y baja calidad del ADN

La calidad del ADN y la contaminación son problemas técnicos que pueden afectar seriamente los resultados del DNA barcoding.

Contaminación:

• Fuentes. Reactivos, equipamiento, manos del investigador, otros organismos en la muestra, ambiente del laboratorio.
• Consecuencias. Resultados falsos positivos (amplificación de ADN extraño), identificaciones falsas, imposibilidad de interpretación.
• Ejemplos. Al analizar medicinas tradicionales, Coghlan et al. (2012) encontraron ADN de oso negro asiático (Ursus thibetanus) y saiga (Saiga tatarica) en muestras donde no estaban declarados. Esto puede ser tanto contaminación como falsificación intencionada.
• Control. Uso de controles negativos en todas las etapas, materiales desechables, esterilización, trabajo en campana de flujo laminar.

Degradación del ADN:

• Causas. Procesamiento (calentamiento, secado, fermentación), almacenamiento (temperatura, humedad), edad de la muestra.
• Consecuencias. Fragmentación del ADN, imposibilidad de amplificar fragmentos largos, errores de secuenciación.
• Ejemplos. Staats et al. (2016) señalaron que en productos alimenticios procesados y medicinas tradicionales, el ADN a menudo está fragmentado a 100–300 pares de bases. Para el análisis de tales muestras se requieren mini-códigos de barras.
• Soluciones. Uso de mini-códigos de barras, métodos especiales de extracción de ADN, aumento del número de ciclos de PCR.

Inhibidores de la PCR:

• Fuentes. Polisacáridos, polifenoles, ácidos húmicos, hemo, sales biliares.
• Consecuencias. Ausencia de amplificación, reducción de la eficiencia de la PCR.
• Soluciones. Purificación adicional del ADN, adición de BSA, PVPP, dilución de la muestra.

Bajo contenido de ADN:

• Ejemplos. Ejemplares de museo antiguos, muestras de herbario, células individuales.
• Soluciones. Whole genome amplification, nested PCR, sistemas de detección sensibles.

4.8. Problemas con grupos específicos de organismos

Diferentes grupos de organismos tienen problemas específicos para el DNA barcoding.

Animales:

• Cnidarios. Hebert et al. (2003) señalaron que COI no distingue especies cercanas de cnidarios debido a la baja velocidad de evolución.
• Nematodos. Powers (2004) demostró que en Meloidogyne el genoma mitocondrial tiene una estructura inusual, lo que limita el uso de COI. ITS también puede dar resultados ambiguos debido al origen híbrido de algunas especies.
• Moluscos. Meyer and Paulay (2005) demostraron que en los gasterópodos la variabilidad intraespecífica de COI puede solaparse con la interespecífica.

Plantas:

• Poliploidía e hibridación. China Plant BOL Group (2011) y Hollingsworth et al. (2011) demostraron que en las plantas los códigos de barras plastídicos a menudo no corresponden a los límites específicos debido a la hibridación y la introgresión.
• Baja capacidad de resolución. CBOL Plant Working Group (2009) señalaron que rbcL + matK distinguen solo el 49,7% de las especies en algunos grupos.
• Problemas con ITS. China Plant BOL Group (2011) descubrieron que ITS puede ser difícil de amplificar en gimnospermas y también puede contener parálogos y pseudogenes.

Hongos:

• Alta variabilidad intraespecífica. Schoch et al. (2012) señalaron que en Glomeromycota la variabilidad intraespecífica de ITS alcanza el 20%.
• Ausencia de cebadores universales. Para algunos grupos de hongos, los cebadores de ITS no funcionan.
• ITS idéntico en diferentes especies. En Aspergillus, Penicillium, Fusarium, ITS puede ser idéntico en varias especies.

Bacterias:

• Limitaciones del ARNr 16S. Janda and Abbott (2007) demostraron que el ARNr 16S proporciona identificación a nivel de especie solo en el 65–83% de los casos.
• Transferencia horizontal de genes. Puede conducir a una falta de correspondencia entre el ARNr 16S y otros genes.
• Múltiples copias. Algunas bacterias tienen varias copias del ARNr 16S con diferentes secuencias.

Oomicetos:

• Problemas con ITS. Robideau et al. (2011) señalaron que en algunos géneros (por ejemplo, Plasmopara) ITS contiene inserciones largas, lo que dificulta la amplificación.
• Variabilidad insuficiente. Para algunos grupos, ITS no distingue especies cercanas.
• Problemas con COI. Choi et al. (2015) demostraron que cox1 no se amplifica en algunos géneros (por ejemplo, Eurychasma, Sclerophthora, Albugo lepigoni).

4.9. Ejemplos prácticos

Ejemplo 1: Mosquitos de Canadá (Cywinska et al., 2006).

Cywinska et al. (2006) realizaron el barcoding de 37 especies de mosquitos de Canadá. Descubrieron:

• Divergencia intraespecífica media de COI: 0,5%
• Divergencia interespecífica media: 10,4%
• Sin embargo, en Aedes fitchii y Ae. grossbecki, la divergencia interespecífica fue baja (0,2–1,1%), mientras que la intraespecífica en Ae. fitchii alcanzaba el 3,6–3,9%
• Una muestra de Culex restuans contenía un codón de parada y 15 sustituciones de aminoácidos, lo que indica un NUMT
• Signos morfológicos de hibridación en Ae. fitchii

Ejemplo 2: Moluscos (Meyer and Paulay, 2005).

Meyer and Paulay (2005) analizaron 2.026 individuos de 263 especies de gasterópodos marinos (Cypraeidae). Descubrieron:

• Divergencia intraespecífica de COI: 0–3,9%
• Divergencia interespecífica: 0–18%
• Umbral óptimo para minimizar errores: 2,6%
• Incluso con el umbral óptimo, el error alcanzaba el 17%
• Cuando se utilizaron especies morfológicas tradicionales, el error aumentaba al 33%

Ejemplo 3: Hongos (Schoch et al., 2012).

Schoch et al. (2012) analizaron 742 cepas de hongos. Descubrieron:

• ITS mostró una probabilidad de identificación correcta de 0,73
• En Glomeromycota, la variabilidad intraespecífica de ITS alcanzaba el 20%
• ITS era idéntico en varias especies de Aspergillus, Penicillium, Fusarium
• RPB1 mostró una resolución más alta pero peor amplificabilidad

Ejemplo 4: Oomicetos (Choi et al., 2015).

Choi et al. (2015) compararon cox1 y cox2 para 31 géneros de oomicetos. Descubrieron:

• cox1 no se amplificó en Eurychasma, Sclerophthora, Albugo lepigoni
• cox2 se amplificó en los 31 géneros
• cox2 mostró mayor divergencia nucleotídica y mejor resolución
• Sin embargo, incluso cox2 no distinguió algunas especies cercanas

5.1. Introducción: de la clave al algoritmo

La taxonomía tradicional se ha basado durante siglos en herramientas analógicas: colecciones de herbario, claves morfológicas, descripciones en floras y faunas. La identificación requería acceso físico a las muestras, conocimientos expertos y un tiempo considerable. La revolución digital de las últimas décadas ha cambiado radicalmente esta situación (Wäldchen and Mäder, 2018; Joly et al., 2016).

La taxonomía digital es un conjunto de métodos y herramientas que utilizan tecnologías digitales para la identificación, descripción y clasificación de organismos. Incluye claves interactivas, bases de datos de imágenes, aplicaciones móviles, aprendizaje automático e identificación automática por ADN (Wäldchen and Mäder, 2018). Estas herramientas no sustituyen a la taxonomía tradicional, pero amplían sus capacidades, haciendo la identificación más rápida, accesible y objetiva.

La fuerza motriz clave de la taxonomía digital ha sido la acumulación de enormes conjuntos de datos: millones de muestras de herbario digitalizadas, millones de fotografías de organismos, millones de secuencias de ADN. Al mismo tiempo, el desarrollo del aprendizaje automático, especialmente las redes neuronales profundas, ha permitido extraer automáticamente patrones de estos datos (Wäldchen and Mäder, 2018; Shen et al., 2026).

En este capítulo examinaremos las principales direcciones de la taxonomía digital y la identificación automática, sus capacidades, limitaciones y perspectivas para la sistemática y el diagnóstico de organismos de la agroesfera.

5.2. Claves digitales: claves interactivas

Las claves dicotómicas tradicionales, descritas en el capítulo 3 del manual de Singh (2019), tienen una limitación significativa: el usuario debe seguir una secuencia fija de caracteres, y si falta información sobre algún carácter, la identificación se vuelve imposible. Las tecnologías digitales han permitido crear claves interactivas libres de este inconveniente (Singh, 2019; Watson et al., 2015).

Claves multiacceso (polyclaves). A diferencia de las claves dicotómicas, las claves multiacceso permiten al usuario elegir los caracteres en cualquier orden. Cada carácter se utiliza para excluir sucesivamente taxones hasta que quede uno o varios candidatos. Esto es especialmente conveniente cuando se trabaja con material incompleto, cuando algunos caracteres no están disponibles (Singh, 2019).

Históricamente, las claves multiacceso se implementaban mediante tarjetas perforadas: body-punched cards (con agujeros en el cuerpo de la tarjeta) y edge-punched cards (con agujeros en el borde). El usuario seleccionaba las tarjetas correspondientes a los caracteres de la muestra y las superponía hasta que quedaba un taxón (Singh, 2019).

Claves interactivas computerizadas. Las claves digitales modernas implementan el mismo principio, pero utilizando programas informáticos. Los sistemas más conocidos son:

• DELTA (DEscription Language for TAxonomy). Sistema desarrollado por CSIRO (Australia) que permite crear descripciones de taxones en un formato estandarizado y, a partir de ellas, generar claves dicotómicas, claves interactivas Intkey y exportar datos para análisis filogenético. DELTA se utiliza para los más diversos grupos de organismos, incluidos hongos, plantas e insectos (Singh, 2019).
• Lucid. Sistema comercial para crear claves interactivas, desarrollado en la Universidad de Queensland (Australia). Incluye Builder (para crear claves) y Player (para utilizarlas). Soporta multimedia, imágenes y fichas descriptivas (Singh, 2019).
• NaviKey. Programa Java gratuito para identificación interactiva que funciona con archivos DELTA. Permite utilizar las claves tanto sin conexión como a través de una interfaz web (Singh, 2019).
• ActKey. Aplicación web desarrollada en el Missouri Botanical Garden, que soporta datos en formatos DELTA, Excel, Access y Lucid. Se utiliza para las floras de China, América del Norte, Madagascar y Borneo (Singh, 2019).
• MEKA (Multiple-Entry Key Algorithm). Programa gratuito para Windows que permite identificar muestras seleccionando caracteres en orden arbitrario. Se convierte al formato SLIKS para uso web (Singh, 2019).
• IdentifyIt. Sistema comercial Linnaeus II para crear bases de datos taxonómicas y claves interactivas (Singh, 2019).

Ventajas de las claves interactivas:

• Posibilidad de utilizar cualquier carácter disponible
• Trabajo con material incompleto
• Posibilidad de incluir imágenes, sonidos, vídeo
• Facilidad de actualización y distribución
• Accesibilidad a través de internet

Limitaciones:

• Requieren la creación y el mantenimiento de una base de datos
• Pueden ser difíciles para no especialistas
• Dependencia de la completitud y calidad de los datos
• Necesidad de equipamiento informático

5.3. Bases de imágenes y colecciones digitales

La digitalización de las colecciones de historia natural es una de las tendencias más importantes de la sistemática moderna. Los herbarios, museos zoológicos y jardines botánicos de todo el mundo están creando imágenes digitales de sus muestras y poniéndolas a disposición a través de internet (Watson et al., 2015; Wäldchen and Mäder, 2018).

Herbarios virtuales. Un herbario virtual es una base de datos que contiene imágenes de muestras de herbario e información complementaria (etiquetas, metadatos). Ventajas de los herbarios virtuales:

• Reducción del desgaste físico de las muestras
• Búsqueda rápida por criterios taxonómicos, geográficos y otros
• Accesibilidad para investigadores de todo el mundo
• Posibilidad de integración con otras bases de datos
• Preservación de la información en caso de pérdida de las muestras físicas (Watson et al., 2015; Singh, 2019)

Ejemplos de herbarios virtuales:

• NYBG Virtual Herbarium (New York Botanical Garden): 850.000 muestras, 120.000 imágenes
• eFTG (Fairchild Tropical Garden): más de 100.000 muestras, integración con otros herbarios
• AVH (Australia's Virtual Herbarium): más de 6 millones de muestras de herbarios australianos
• ePIC (Royal Botanic Gardens, Kew): 577.156 muestras digitalizadas, incluidas 170.760 tipos
• iDigBio: agregador de datos de museos de EE. UU., más de 1,8 millones de imágenes georreferenciadas de plantas vasculares (Watson et al., 2015; Wäldchen and Mäder, 2018)

Imágenes digitales de organismos vivos. Además de las muestras de herbario, se están creando enormes bases de datos de fotografías de organismos vivos en la naturaleza. Ejemplos:

• iNaturalist: más de 6,6 millones de observaciones, 127.000 especies (Wäldchen and Mäder, 2018)
• Encyclopedia of Life (EoL): información sobre todos los organismos, incluidas imágenes (Schierwater and DeSalle, 2022)
• CalPhotos: más de 640.000 imágenes de plantas, animales, fósiles (Singh, 2019)
• Plant Systematics website (Cornell University): más de 20.000 imágenes de plantas vasculares (Watson et al., 2015)

Problemas de las colecciones digitales:

• Calidad de las imágenes. No todas las imágenes tienen resolución suficiente para la identificación.
• Falta de estandarización. Diferentes instituciones utilizan diferentes formatos, metadatos y protocolos.
• Errores de identificación. No todas las muestras en las bases de datos están identificadas correctamente.
• Incompletitud. Muchas especies, especialmente raras y tropicales, están poco representadas.
• Derechos de autor. No todas las imágenes están disponibles para uso libre.

5.4. Aplicaciones móviles para la identificación

El desarrollo de teléfonos inteligentes con cámaras potentes y acceso a internet ha creado una nueva oportunidad para la identificación de organismos: aplicaciones móviles que utilizan aprendizaje automático. Estas aplicaciones hacen que la identificación sea accesible para el público general, incluidos agricultores, estudiantes, jardineros y científicos ciudadanos (Wäldchen and Mäder, 2018; Joly et al., 2016).

Pl@ntNet. Una de las aplicaciones más conocidas para la identificación de plantas. Desarrollada por un consorcio de organizaciones de investigación francesas (Cirad, INRA, Inria, IRD) junto con la red Tela Botanica (Joly et al., 2016; Wäldchen and Mäder, 2018).

Pl@ntNet permite:

• Subir una o varias fotografías de una planta (flor, hoja, fruto, corteza)
• Obtener una lista de las especies más probables con estimaciones de confianza
• Ver imágenes y descripciones de la base de datos
• Compartir una observación con la comunidad
• Participar en la validación y el enriquecimiento de la base de datos

Una característica clave de Pl@ntNet es el uso del crowdsourcing para la recolección y validación de datos. Los usuarios pueden subir sus observaciones, que son verificadas por expertos y la comunidad. Esto crea un sistema auto-mejorable: cuantos más datos, mejor la identificación (Joly et al., 2016).

Desde 2015, Pl@ntNet utiliza aprendizaje profundo (CNN preentrenada en ImageNet y ajustada con datos de Pl@ntNet). Esto condujo a una mejora significativa de la precisión: la calificación de la aplicación en Google Play subió de 3,2 a 4,3 (Wäldchen and Mäder, 2018).

Limitaciones de Pl@ntNet:

• La precisión varía según el grupo de plantas y la calidad de la imagen
• La base de datos estaba inicialmente orientada a la flora europea, pero se está ampliando
• Para algunos grupos (por ejemplo, gramíneas, ciperáceas), la precisión es menor
• Los usuarios deben tratar los resultados con criterio, especialmente para especies raras (Joly et al., 2016; Kuchařová et al., 2025)

iNaturalist / Seek. iNaturalist es una plataforma de ciencia ciudadana que permite a los usuarios subir observaciones de organismos. Una comunidad de expertos y aficionados identifica las observaciones; cuando 2/3 de los identificadores están de acuerdo, la observación recibe el estatus de «research grade» (Wäldchen and Mäder, 2018).

Seek by iNaturalist es una aplicación móvil para la identificación automática en tiempo real. Utiliza la cámara del teléfono inteligente para reconocer plantas, animales y hongos. A diferencia de iNaturalist, Seek no requiere registro y no transmite datos a la base de datos común (Kuchařová et al., 2025).

Kuchařová et al. (2025) probaron Seek en 40 especies de coníferas en un jardín botánico de la República Checa. Los resultados mostraron:

• Precisión a nivel de especie: 38,75%
• Precisión a nivel de género: 92,5%
• Las especies comunes con caracteres llamativos se identificaron con mayor éxito (Larix decidua, Picea abies, Thuja occidentalis)
• Las especies raras y las especies con morfología compleja se identificaron mal
• La iluminación influyó en la precisión: mejor con nubosidad ligera (luz difusa)

LeafSnap. Aplicación para identificar árboles a partir de fotografías de hojas. Desarrollada por Columbia University, University of Maryland y Smithsonian Institution. Utiliza visión por computadora para analizar la forma de la hoja (Wäldchen and Mäder, 2018).

Merlin Bird ID (Photo ID). Aplicación del Cornell Laboratory of Ornithology para identificar aves a partir de fotografías. Utiliza TensorFlow y datos de eBird para generar una lista de especies probables teniendo en cuenta la fecha y la ubicación (Wäldchen and Mäder, 2018).

BirdNET. Aplicación para la identificación automática de aves por sonido. Desarrollada por el Cornell Lab of Ornithology y la Chemnitz University of Technology. Utiliza CNN para analizar grabaciones de audio. BirdNET es capaz de identificar más de 3.000 especies de aves (Usman et al., 2025; Shen et al., 2026).

Usman et al. (2025) realizaron una revisión sistemática de 25 estudios que utilizan BirdNET. Conclusiones principales:

• La precisión (precision) varía del 72% al 85%
• La exhaustividad (recall) varía del 33% al 84%
• La precisión depende de la especie, la calidad de la grabación y el umbral de confianza
• Sesgo geográfico: la mayoría de los estudios se realizaron en América del Norte (64,2%) y Europa (50%)
• Las regiones tropicales están poco representadas

Problemas generales de las aplicaciones móviles:

• Sesgo geográfico y taxonómico. Los modelos se entrenan principalmente con datos de América del Norte y Europa, lo que reduce la precisión para otras regiones (Usman et al., 2025; Kuchařová et al., 2025).
• Falta de datos de entrenamiento. Para muchos grupos (hongos, invertebrados, plantas tropicales), los datos son insuficientes.
• «Caja negra». El usuario no ve en qué caracteres se basó la decisión, lo que dificulta la verificación.
• Errores de los algoritmos. Los resultados falsos positivos y falsos negativos pueden conducir a conclusiones incorrectas.
• Dependencia de la calidad de la imagen. La iluminación, el ángulo y el fondo influyen en la precisión.

5.5. Aprendizaje automático para la identificación

El aprendizaje automático (machine learning) es la tecnología clave que subyace a los sistemas modernos de identificación automática. Wäldchen and Mäder (2018) ofrecen una revisión de la aplicación del aprendizaje automático para la identificación de especies a partir de imágenes.

Conceptos básicos:

• Características (features). Características numéricas de una imagen utilizadas para la clasificación. Tradicionalmente, las características eran diseñadas manualmente por expertos (forma, textura, color). Los métodos modernos de aprendizaje profundo extraen las características automáticamente.
• Clasificador (classifier). Algoritmo que, a partir de las características, asigna un objeto a una clase (especie). Ejemplos: máquina de vectores de soporte (SVM), bosque aleatorio (Random Forest), redes neuronales artificiales (ANN).
• Entrenamiento (training). Proceso de ajuste de los parámetros del clasificador en un conjunto de entrenamiento.
• Inferencia (inference). Aplicación del clasificador entrenado a nuevos datos.

Redes neuronales convolucionales (CNN). Las CNN son una clase de redes neuronales profundas diseñadas específicamente para el análisis de imágenes. La arquitectura CNN incluye:

• Capas convolucionales. Extraen características locales (bordes, texturas, formas) mediante filtros.
• Capas de submuestreo (pooling). Reducen la dimensionalidad y proporcionan invariancia al desplazamiento.
• Capas totalmente conectadas. Clasifican las características extraídas.

La ventaja clave de las CNN es la extracción automática de características. En lugar del diseño manual de características, la red aprende por sí misma qué características son importantes para distinguir especies (Wäldchen and Mäder, 2018).

Historia del desarrollo de las CNN:

• Década de 1980: Neocognitron (Fukushima and Miyake, 1982)
• 1998: LeNet (LeCun et al., 1998): reconocimiento de dígitos manuscritos
• 2012: AlexNet (Krizhevsky et al., 2012): victoria en ImageNet, reducción del error del 26% al 15%
• 2014: VGGNet, GoogLeNet
• 2015: ResNet: primera arquitectura que superó al humano en ImageNet
• Actualidad: modelos basados en Transformer, modelos fundacionales

Aplicación de las CNN para la identificación de especies:

• Plantas. PlantCLEF: competencia internacional de identificación de plantas. De 2011 a 2017, la precisión creció de 0,47 a 0,92 (mAP) gracias a la transición al aprendizaje profundo. En 2017, el conjunto de datos incluía 10.000 especies y 1,6 millones de imágenes (Wäldchen and Mäder, 2018).
• Animales. Las CNN se utilizan con éxito para identificar mamíferos (Norouzzadeh et al., 2018), peces (Qin et al., 2016; Salman et al., 2016), insectos (Marques et al., 2018; Cheng et al., 2017) e invertebrados acuáticos (Raitoharju et al., 2016).
• Muestras de herbario. Carranza-Rojas et al. (2017) aplicaron CNN a 260.000 escaneos de pliegos de herbario (1.204 especies) y alcanzaron una precisión del 80% (top-1) y del 90% (top-5). Sin embargo, la transferencia de aprendizaje de muestras de herbario a fotografías de campo resultó imposible debido a las diferencias en los caracteres visuales (Wäldchen and Mäder, 2018).

Identificación por sonido. Además de las imágenes, las CNN se utilizan para el análisis de sonidos. BirdNET (Kahl et al., 2021) utiliza CNN para identificar aves por sus cantos. Shen et al. (2026) describen la evolución de los métodos de reconocimiento automático de sonidos de aves desde características manuales (MFCC) hasta el aprendizaje profundo y los modelos fundacionales (Bird-MAE, Perch 2.0).

Identificación por secuencias de ADN. El aprendizaje automático también se aplica al análisis de secuencias de códigos de barras. Por ejemplo, ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery) utiliza métodos estadísticos para dividir automáticamente las secuencias en especies hipotéticas (Puillandre et al., 2012). Otros métodos incluyen GMYC (General Mixed Yule Coalescent), la delimitación bayesiana y el aprendizaje automático para la clasificación taxonómica.

Problemas del aprendizaje automático:

• Falta de datos. Para muchos grupos y regiones, los datos de entrenamiento son insuficientes. Esto es especialmente agudo para las regiones tropicales y los taxones poco estudiados (Usman et al., 2025).
• Desequilibrio de clases. Algunas especies están representadas por muchas imágenes, otras por unas pocas. Esto sesga el modelo hacia las clases frecuentes (Van Horn et al., 2018).
• Sobreajuste. El modelo puede memorizar los datos de entrenamiento y funcionar mal con datos nuevos.
• «Caja negra». Los modelos complejos (especialmente las redes profundas) no proporcionan explicaciones interpretables de sus decisiones. Esto dificulta la verificación y genera desconfianza (Wäldchen and Mäder, 2018; Shen et al., 2026).
• Desplazamiento de dominio (domain shift). Un modelo entrenado con un tipo de datos (por ejemplo, muestras de herbario) puede funcionar mal con otro (fotografías de campo) (Wäldchen and Mäder, 2018).
• Sesgo geográfico. Los modelos entrenados con datos de América del Norte y Europa muestran peores resultados en otras regiones (Usman et al., 2025).

5.6. Identificación automática por ADN

Además de la identificación por imágenes y sonidos, la taxonomía digital incluye la identificación automática por secuencias de ADN. Esta dirección incluye el metabarcoding y el mini-barcoding (Deiner et al., 2017; Staats et al., 2016).

Metabarcoding. El metabarcoding es un método de análisis de mezclas complejas de organismos mediante secuenciación de alto rendimiento (HTS). A diferencia del DNA barcoding clásico, que analiza muestras individuales, el metabarcoding permite identificar simultáneamente muchas especies en una muestra (Deiner et al., 2017).

Workflow del metabarcoding:

1. Extracción de ADN de una muestra mixta (suelo, agua, contenido estomacal, producto alimenticio)

2. Amplificación de la región del código de barras con cebadores universales

3. Secuenciación de alto rendimiento de los amplicones

4. Análisis bioinformático: agrupación en MOTU (Molecular Operational Taxonomic Units), comparación con una base de datos de referencia

5. Identificación de especies y evaluación de su abundancia relativa

Aplicaciones del metabarcoding:

• Ecología. Evaluación de la biodiversidad del suelo, agua y aire (Deiner et al., 2017)
• Dieta. Análisis de contenidos estomacales y heces (Deiner et al., 2017)
• Control de calidad de productos. Detección de falsificaciones, identificación de componentes de medicinas tradicionales (Staats et al., 2016; Coghlan et al., 2012)
• Bioseguridad. Detección de especies invasoras y organismos cuarentenarios (Staats et al., 2016)
• Criminalística. Análisis del comercio ilegal de especies (Staats et al., 2016)

Mini-barcoding. Para el análisis de ADN degradado (productos procesados, muestras antiguas) se utilizan mini-códigos de barras: fragmentos acortados de códigos de barras estándar (100–300 pares de bases). Ventajas: mejor amplificabilidad. Desventajas: menor capacidad de resolución (Staats et al., 2016).

Metabarcoding en agronomía:

• Diagnóstico de enfermedades de plantas (Robideau et al., 2011; Choi et al., 2015)
• Identificación de plagas (Powers, 2004)
• Monitoreo de la biodiversidad de agrocenosis (Deiner et al., 2017)
• Control de calidad de semillas y material de plantación (Staats et al., 2016)

Problemas del metabarcoding:

• Sesgo de cebadores (primer bias). Diferentes especies pueden amplificarse con diferente eficiencia, lo que distorsiona la estimación de la abundancia relativa (Deiner et al., 2017).
• Incompletitud de las bases de referencia. Muchas especies están ausentes de las bases de datos, lo que conduce a la imposibilidad de identificación (Staats et al., 2016).
• Errores de secuenciación. Aunque las plataformas modernas proporcionan alta precisión, los errores aún son posibles.
• Quimeras. Durante la PCR pueden formarse secuencias quiméricas que deben eliminarse (Deiner et al., 2017).
• Contaminación. La contaminación de la muestra con ADN extraño puede conducir a resultados falsos (Staats et al., 2016).

5.7. Integración de datos: morfología + moléculas + geografía + ecología

La taxonomía digital moderna aspira a integrar diferentes tipos de datos para una identificación y delimitación de especies más fiables. Este enfoque, conocido como taxonomía integrativa (integrative taxonomy), combina datos morfológicos, moleculares, geográficos y ecológicos (Schierwater and DeSalle, 2022; Watson et al., 2015).

Taxonomía integrativa. Dayrat (2005) definió la taxonomía integrativa como un enfoque que utiliza todos los datos disponibles para la delimitación de especies. En lugar de basarse en un solo tipo de datos, la taxonomía integrativa combina:

• Morfología. Caracteres diagnósticos tradicionales.
• Datos moleculares. Secuencias de códigos de barras, marcadores filogenéticos.
• Geografía. Distribución, simpatría/alopatría.
• Ecología. Hábitat, hospedadores, comportamiento.
• Otros datos. Cariología, bioquímica, sonidos, feromonas.

Schierwater and DeSalle (2022) describen el «círculo taxonómico»: la hipótesis sobre la existencia de una especie se formula sobre la base de datos geográficos o morfológicos y luego se prueba con datos independientes. Si al menos una fuente de datos confirma la hipótesis, la especie puede ser descrita. Si todas las fuentes rechazan la hipótesis, la especie no se reconoce.

Ejemplos de taxonomía integrativa:

• Helechos. Uso de rbcL, matK, trnH-psbA junto con la morfología para la identificación de especies (Kumar et al., 2022)
• Nematodos. Combinación de SSU, ITS, COI con la morfología para la delimitación de especies (Powers, 2004)
• Oomicetos. ITS, COX1, COX2 junto con la morfología y la patogenicidad (Robideau et al., 2011; Choi et al., 2015)
• Hongos. ITS, RPB1, RPB2, MCM7 junto con la morfología y la ecología (Schoch et al., 2012)

Plataformas digitales para la integración de datos:

• BOLD. Integra secuencias, imágenes, metadatos, geografía (Ratnasingham and Hebert, 2007)
• GBIF. Global Biodiversity Information Facility: agregador de datos sobre la distribución de organismos (Watson et al., 2015)
• EoL. Encyclopedia of Life: información sobre todos los organismos (Schierwater and DeSalle, 2022)
• iDigBio. Agregador de datos de museos de EE. UU. (Wäldchen and Mäder, 2018)

Problemas de la integración:

• Incompatibilidad de formatos. Diferentes bases de datos utilizan diferentes estándares.
• Ausencia de identificadores únicos. La vinculación de datos de diferentes fuentes es difícil.
• Calidad de los datos. No todos los datos están verificados y curados.
• Aspectos éticos y legales. Acceso a los datos, derechos de autor, privacidad.

5.8. Problemas de la identificación automática

La identificación automática, a pesar de los éxitos impresionantes, tiene una serie de problemas significativos que deben tenerse en cuenta en el uso práctico.

Errores de los algoritmos. Ningún algoritmo da una precisión del 100%. Los errores pueden ser:

• Falsos positivos. La muestra se asigna a una especie a la que no pertenece.
• Falsos negativos. La muestra no se asigna a la especie a la que pertenece.
• Ambiguos. La muestra se asigna a varias especies con puntuaciones similares.

Usman et al. (2025) demostraron que la precisión de BirdNET varía del 72% al 85%, y la exhaustividad del 33% al 84%. La precisión depende de la especie, la calidad de la grabación y el umbral de confianza. Por ejemplo, para el Common Raven, la precisión varió de 0,29 a 0,94 en diferentes estudios.

Falta de datos de entrenamiento. El entrenamiento de modelos requiere una gran cantidad de datos etiquetados. Para muchos grupos y regiones, tales datos son insuficientes:

• Las regiones tropicales están poco representadas (Usman et al., 2025)
• Las especies raras están representadas por imágenes únicas (Van Horn et al., 2018)
• Algunos grupos (hongos, invertebrados, protistas) están mal muestreados (Wäldchen and Mäder, 2018)

Desequilibrio de clases. En la naturaleza, algunas especies son comunes y otras raras. En los datos de entrenamiento, esto conduce a un desequilibrio: los modelos reconocen mejor las especies frecuentes y peor las raras (Van Horn et al., 2018).

«Caja negra». Las redes neuronales profundas no proporcionan explicaciones interpretables de sus decisiones. El usuario no ve en qué caracteres se basó la decisión. Esto dificulta:

• La verificación de la corrección de la identificación
• La detección de errores
• La formación de los usuarios
• La confianza en los resultados (Wäldchen and Mäder, 2018; Shen et al., 2026)

Desplazamiento de dominio. Un modelo entrenado con un tipo de datos puede funcionar mal con otro. Por ejemplo, un modelo entrenado con muestras de herbario funciona mal con fotografías de campo (Wäldchen and Mäder, 2018). Un modelo entrenado con grabaciones de América del Norte funciona peor en los trópicos (Usman et al., 2025).

Sesgo geográfico. La mayoría de los datos de entrenamiento se han obtenido en América del Norte y Europa. Esto crea desigualdad: los modelos funcionan bien en unas regiones y mal en otras (Usman et al., 2025; Kuchařová et al., 2025).

Dependencia de la calidad de los datos de entrada. La precisión de la identificación depende en gran medida de la calidad de la imagen o el sonido:

• Iluminación (Kuchařová et al., 2025)
• Ángulo, fondo
• Ruido, solapamiento de señales (Usman et al., 2025)
• Resolución, enfoque

Falta de estandarización. Diferentes aplicaciones y bases de datos utilizan diferentes formatos, protocolos y criterios. Esto dificulta la comparación de resultados y la integración de datos (Usman et al., 2025).

5.9. Perspectivas de la taxonomía digital

A pesar de los problemas, la taxonomía digital se desarrolla rápidamente. Direcciones principales del futuro:

Mejora de los modelos. El desarrollo de arquitecturas (transformers, modelos fundacionales) y métodos de entrenamiento (self-supervised learning, few-shot learning) permite aumentar la precisión y reducir la necesidad de datos etiquetados (Shen et al., 2026).

Ampliación de los datos de entrenamiento. Los proyectos de digitalización de colecciones, la ciencia ciudadana y el crowdsourcing permiten acumular cada vez más datos (Wäldchen and Mäder, 2018).

Integración de datos. Desarrollo de estándares y plataformas para la integración de datos morfológicos, moleculares, geográficos y ecológicos (Watson et al., 2015).

Interpretabilidad. Desarrollo de métodos de IA explicable (explainable AI) para aumentar la confianza y la comprensión de las decisiones de los algoritmos (Shen et al., 2026).

Dispositivos portátiles. Desarrollo de laboratorios de campo, secuenciadores portátiles (MinION) y aplicaciones móviles para la identificación en tiempo real (Jain et al., 2016).

Aspectos éticos. Desarrollo de normas éticas para la recolección, el almacenamiento y el uso de datos genéticos, la protección de la privacidad y la prevención de la biopiratería (Bond and Scott, 2020).

6.1. Introducción: equilibrio entre entusiasmo y evaluación crítica

El DNA barcoding y la taxonomía digital han revolucionado la práctica de la sistemática y el diagnóstico. Sin embargo, como cualquier tecnología, tienen límites de aplicabilidad. En los capítulos anteriores hemos examinado cómo funciona el barcoding, cuándo es eficaz y cuándo falla. En este capítulo resumiremos las limitaciones del método y discutiremos las perspectivas de su desarrollo, incluidas las innovaciones tecnológicas, los enfoques integrativos y los aspectos éticos (Collins and Cruickshank, 2013; Taylor and Harris, 2012).

La tesis clave de este capítulo: el DNA barcoding es una herramienta poderosa pero no universal. No sustituye a la morfología y a la experiencia taxonómica, sino que las complementa. La taxonomía digital amplía las capacidades del investigador, pero requiere pensamiento crítico y comprensión de las limitaciones (Schierwater and DeSalle, 2022; Wäldchen and Mäder, 2018).

6.2. Limitaciones del DNA barcoding

6.3. Perspectivas: secuenciadores portátiles y laboratorios de campo

A pesar de las limitaciones, las innovaciones tecnológicas abren nuevas posibilidades para el DNA barcoding y la taxonomía digital. Una de las direcciones más prometedoras es la miniaturización y portabilidad del equipamiento.

6.4. Futuro: taxonomía integrativa y redes globales

6.5. Aspectos éticos

El desarrollo del DNA barcoding y la taxonomía digital plantea una serie de cuestiones éticas que requieren atención.

7.1. Introducción: por qué la agronomía necesita el código de barras de ADN

La agronomía es un ámbito en el que la identificación precisa de los organismos tiene una importancia crítica. Las enfermedades de las plantas, las plagas, las especies arvenses, los organismos de cuarentena, los simbiontes y los patógenos: todo ello requiere una determinación rápida y fiable. El diagnóstico morfológico tradicional a menudo se enfrenta a limitaciones: las larvas y los huevos de las plagas son difíciles de distinguir, los patógenos en la fase inicial de la infección no presentan caracteres diagnósticos, y el material fragmentado (partes de plantas, tejidos dañados) no puede determinarse (Powers, 2004; Armstrong and Ball, 2005).

El código de barras de ADN y la taxonomía digital ofrecen soluciones a estos problemas. Permiten:

• Identificar organismos en cualquier fase del ciclo vital (huevos, larvas, adultos).
• Determinar especies a partir de fragmentos de tejidos, semillas, muestras dañadas.
• Realizar el diagnóstico de forma rápida y estandarizada.
• Detectar especies crípticas, que son morfológicamente indistinguibles pero difieren en ecología, patogenicidad o resistencia a los pesticidas (Bickford et al., 2007; Armstrong and Ball, 2005).

En este capítulo examinaremos las principales direcciones del uso práctico del código de barras de ADN y la taxonomía digital en agronomía: diagnóstico de enfermedades y plagas, cuarentena, certificación de semillas, monitorización de la biodiversidad de agrocenosis y control de calidad de productos.

7.2. Diagnóstico de enfermedades y plagas

7.3. Cuarentena y bioseguridad

7.4. Certificación de semillas y material de plantación

7.5. Monitorización de la biodiversidad de agrocenosis

7.6. Control de calidad de productos

7.7. Ejemplos de aplicación exitosa

7.8. Limitaciones y problemas

A pesar de los éxitos, la aplicación del código de barras de ADN en agronomía se enfrenta a una serie de limitaciones (Collins and Cruickshank, 2013; Taylor and Harris, 2012; Staats et al., 2016).

Insuficiencia de las bases de referencia. Para muchas plagas y patógenos agrícolas faltan secuencias de referencia o son fragmentarias. Esto es especialmente grave para regiones tropicales y grupos poco estudiados (Taylor and Harris, 2012; Usman et al., 2025).

Sesgo geográfico. La mayoría de los datos proceden de América del Norte y Europa. Para otras regiones la precisión de la identificación es menor (Usman et al., 2025).

Especies crípticas. Muchas plagas y patógenos representan complejos crípticos que no se distinguen por los códigos de barras estándar (Bickford et al., 2007; Meyer and Paulay, 2005).

Hibridación y poliploidía. En las plantas, la hibridación y la poliploidía dificultan la identificación (China Plant BOL Group, 2011; Hollingsworth et al., 2011).

Degradación del ADN. En productos procesados, muestras antiguas y especímenes de herbario el ADN puede estar fragmentado. Para el análisis se requieren mini-códigos de barras (Staats et al., 2016).

Contaminación. La contaminación de las muestras con ADN extraño puede dar resultados falsos (Collins and Cruickshank, 2013; Staats et al., 2016).

Coste y equipamiento. Para realizar el código de barras de ADN se requiere equipamiento de laboratorio y personal capacitado. Esto puede ser una limitación para pequeñas explotaciones y países en desarrollo (Jain et al., 2016).

Interpretación de resultados. Los resultados del código de barras de ADN no siempre son inequívocos. Para una correcta interpretación se necesitan conocimientos sobre la biología, la ecología y la taxonomía de los organismos (Collins and Cruickshank, 2013).

8.1. Síntesis del material estudiado

Hemos examinado el código de barras de ADN y la taxonomía digital como direcciones interconectadas de la sistemática y el diagnóstico modernos de organismos. A lo largo de siete capítulos hemos analizado sucesivamente los fundamentos teóricos del método, su implementación tecnológica, sus áreas de aplicación, sus limitaciones y sus perspectivas. Ha llegado el momento de generalizar las conclusiones clave y formular recomendaciones prácticas para los especialistas en sistemática y taxonomía de organismos de la agrosfera.

La conclusión central de la lección puede formularse así: el código de barras de ADN es una herramienta potente, pero no universal; la taxonomía digital amplía las posibilidades del investigador, pero exige pensamiento crítico; el enfoque óptimo es la combinación de métodos clásicos y moleculares (Collins and Cruickshank, 2013; Taylor and Harris, 2012; Schierwater and DeSalle, 2022).

Esta conclusión no es trivial. Refleja la evolución de las ideas sobre el papel de los métodos moleculares en la sistemática: desde el entusiasmo inicial, cercano a la expectativa de una sustitución completa de la morfología, hasta una comprensión más equilibrada de las posibilidades y limitaciones de cada enfoque (Hebert et al., 2003; Taylor and Harris, 2012).

8.2. Qué hemos aprendido sobre el código de barras de ADN

8.3. Qué hemos aprendido sobre la taxonomía digital

8.4. Conclusiones prácticas para la agronomía

Para los especialistas en sistemática y taxonomía de organismos de la agrosfera, el código de barras de ADN y la taxonomía digital abren amplias posibilidades (capítulo 7):

1. Diagnóstico de enfermedades y plagas. Identificación de patógenos y plagas en cualquier fase del ciclo vital (Powers, 2004; Robideau et al., 2011; Schoch et al., 2012; Janda and Abbott, 2007; Armstrong and Ball, 2005).

2. Cuarentena y bioseguridad. Identificación rápida de organismos de cuarentena, monitorización de especies invasoras (Armstrong and Ball, 2005; Floyd et al., 2010; Deiner et al., 2017).

3. Certificación de semillas y material de plantación. Control de pureza genética y estado fitosanitario (Staats et al., 2016; CBOL Plant Working Group, 2009; China Plant BOL Group, 2011).

4. Monitorización de la biodiversidad de agrocenosis. Metabarcoding de suelo, agua y aire; monitorización acústica; identificación automática por imágenes (Deiner et al., 2017; Usman et al., 2025; Shen et al., 2026; Wäldchen and Mäder, 2018).

5. Control de calidad de productos. Detección de falsificación de carne, pescado, productos vegetales, miel, productos lácteos y medicamentos tradicionales (Galimberti et al., 2013; Staats et al., 2016; Coghlan et al., 2012).

Sin embargo, la aplicación práctica exige tener en cuenta las limitaciones: insuficiencia de bases de referencia, sesgo geográfico, especies crípticas, hibridación, degradación del ADN, contaminación, coste y complejidad de interpretación (Collins and Cruickshank, 2013; Taylor and Harris, 2012; Staats et al., 2016).

8.5. Principios clave para el uso crítico de los datos moleculares

Sobre la base de todo el material expuesto pueden formularse varios principios que ayudarán a los especialistas a utilizar críticamente el código de barras de ADN y la taxonomía digital.

Principio 1: Comprende las limitaciones del método. El código de barras de ADN no funciona universalmente. Puede fallar con especies cercanamente emparentadas, hibridación, poliploidía y alta variabilidad intraespecífica. Conocer estas limitaciones es el primer paso para interpretar correctamente los resultados (Collins and Cruickshank, 2013; Meyer and Paulay, 2005).

Principio 2: Verifica la base de referencia. El resultado de la identificación depende de la exhaustividad y calidad de la base de referencia. Asegúrate de que la especie a la que se atribuye la muestra está realmente representada en la base y de que la secuencia está vinculada a un voucher (Ratnasingham and Hebert, 2007; Collins and Cruickshank, 2013).

Principio 3: No confíes en un solo marcador. Para grupos complejos utiliza varios marcadores independientes (enfoque multilocus). Esto aumenta la fiabilidad de la identificación y permite detectar discordancias (China Plant BOL Group, 2011; Schoch et al., 2012).

Principio 4: Combina datos moleculares y morfológicos. El código de barras de ADN no sustituye a la morfología. La taxonomía integradora, que une distintos tipos de datos, ofrece los resultados más fiables (Dayrat, 2005; Schierwater and DeSalle, 2022).

Principio 5: Ten en cuenta el contexto. La identificación debe considerar la geografía, la ecología y la biología del organismo. La secuencia de ADN es solo una de las muchas fuentes de información (Schierwater and DeSalle, 2022).

Principio 6: Sé transparente. Al publicar resultados, indica el método de extracción de ADN, los cebadores, las condiciones de PCR, la base de referencia y los umbrales de similitud. Esto garantiza la reproducibilidad y permite a otros investigadores evaluar la fiabilidad de los resultados (Collins and Cruickshank, 2013).

Principio 7: Mantén una actitud crítica ante las identificaciones automáticas. Las aplicaciones móviles y el aprendizaje automático son herramientas útiles, pero no son infalibles. Verifica los resultados, especialmente para especies raras y complejas (Wäldchen and Mäder, 2018; Kuchařová et al., 2025; Usman et al., 2025).

8.6. Futuro: taxonomía integradora y redes globales

El futuro de la sistemática y el diagnóstico está en la taxonomía integradora y las redes globales (Schierwater and DeSalle, 2022; Watson et al., 2015).

Taxonomía integradora une datos morfológicos, moleculares, ecológicos y biogeográficos para delimitar especies. Este enfoque se está convirtiendo en el estándar de la sistemática moderna. La hipótesis sobre la existencia de una especie se plantea sobre la base de unos datos y se comprueba con otros. La especie se reconoce si distintas fuentes de datos confirman su existencia (Dayrat, 2005; Schierwater and DeSalle, 2022).

Redes globales — BOLD, GBIF, EoL, iDigBio — proporcionan acceso a millones de registros, imágenes y secuencias. El desarrollo de estándares y de la interoperabilidad permite integrar datos de distintas fuentes (Ratnasingham and Hebert, 2007; Watson et al., 2015).

Inteligencia artificial — foundation models, few-shot learning, self-supervised learning — abre nuevas posibilidades para la identificación automática, especialmente para especies raras y grupos poco estudiados (Shen et al., 2026; Wäldchen and Mäder, 2018).

Tecnologías portátiles — MinION, diagnóstico CRISPR, laboratorios de campo — hacen el código de barras de ADN accesible en condiciones de campo, lo que es especialmente importante para la cuarentena, las expediciones y la agricultura (Jain et al., 2016).

Aspectos éticos — privacidad de los datos genéticos, biopiratería, distribución justa de beneficios — requieren atención y regulación a nivel internacional (Bond and Scott, 2020).

8.8. Resumen

El código de barras de ADN y la taxonomía digital han revolucionado la práctica de la sistemática y el diagnóstico. Han hecho la identificación más rápida, accesible y objetiva. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones: no sustituyen a la morfología ni a la experiencia taxonómica, dependen de las bases de referencia y pueden fallar en casos de hibridación, poliploidía y especies crípticas.

El enfoque óptimo es la combinación de métodos clásicos y moleculares, el uso crítico de los datos moleculares y la integración de distintos tipos de datos. El código de barras de ADN es una herramienta potente, pero no universal. La taxonomía digital amplía las posibilidades, pero exige pensamiento crítico.

El futuro de la sistemática está en la taxonomía integradora, las redes globales, la inteligencia artificial y las tecnologías portátiles. Pero en el centro de todo ello sigue estando la experiencia biológica fundamental, sin la cual ninguna tecnología podrá sustituir la comprensión de la naturaleza viva.

Como escribieron Schierwater and DeSalle (2022), la taxonomía no es simplemente la asignación de nombres, sino una hipótesis sobre la existencia de una especie que se comprueba con distintos datos. El código de barras de ADN es una de las herramientas de comprobación, pero no la única ni siempre la decisiva. La verdadera comprensión de la biodiversidad exige la síntesis de todos los datos disponibles y un conocimiento profundo de la biología de los organismos.