Virus y viroides: una taxonomía especial

No tienen estructura celular; parásitos intracelulares obligados

Lo primero y más importante que hay que asimilar: los virus son fundamentalmente diferentes de todos los demás seres vivos conocidos. A diferencia de bacterias, hongos, plantas y animales, los virus no tienen estructura celular. Representan una forma de vida no celular. En esencia, un virus es una nucleoproteína, es decir, un complejo formado por ácido nucleico (material genético) y proteína (Agrios, 2005). La cubierta proteica, llamada cápside, protege el material genético y asegura su entrega a la célula hospedadora.

De esto se deriva una segunda característica fundamental: los virus son parásitos intracelulares obligados. Esto significa que son absolutamente incapaces de reproducirse fuera de una célula viva. No tienen metabolismo propio; no pueden sintetizar proteínas ni producir energía por sí mismos. Para reproducirse, el virus debe penetrar en una célula hospedadora (ya sea vegetal, animal o bacteriana) y reprogramar por completo sus recursos metabólicos para producir componentes virales (Agrios, 2005). El virus no "come" la célula ni la mata con toxinas, como hacen muchas bacterias. En su lugar, utiliza sus recursos, ocupa el espacio intracelular y altera los procesos celulares normales, lo que finalmente conduce a la enfermedad (Agrios, 2005).

Estatus controvertido: ¿vivos o no vivos?

Esta característica da lugar a uno de los debates más interesantes y antiguos de la biología: ¿están vivos los virus? Por un lado, poseen material genético, son capaces de replicarse (reproducirse) y evolucionar, lo que los acerca a los organismos vivos. Por otro lado, no son células, no tienen metabolismo propio y no pueden reproducirse por sí mismos, lo que los hace similares a compuestos químicos complejos.

La ciencia moderna propone considerar a los virus no como "vivos" o "no vivos" en el sentido habitual, sino como una forma especial de existencia de la información genética (Koonin, 2021). Se encuentran en la frontera entre el mundo de lo vivo y lo no vivo, y esta posición única los convierte en un objeto indispensable para estudiar cuestiones biológicas fundamentales, incluido el origen de la vida (Koonin, 2021).

Enorme diversidad y papel ecológico

A pesar de su aparente simplicidad estructural, los virus son un grupo increíblemente diverso. Según las estimaciones, su número total supera las 2000 especies conocidas por la ciencia, y se descubren nuevas casi mensualmente (Agrios, 2005). Afectan a todas las formas de vida: desde bacterias y arqueas hasta plantas, hongos y animales. Casi la mitad de los virus conocidos causan enfermedades en plantas (Agrios, 2005).

El papel ecológico de los virus es enorme y multifacético. Son un factor importantísimo de regulación del tamaño de las poblaciones de sus hospedadores. En los ecosistemas acuáticos, por ejemplo, los virus desempeñan un papel clave en el control de la abundancia del fitoplancton, influyendo en los ciclos biogeoquímicos globales. Los virus también son un potente motor de la evolución, ya que participan en la transferencia horizontal de genes entre organismos (Koonin, 2021).

Importancia para la agricultura: pérdidas de cosechas, cuarentena, certificación

Para nosotros, como especialistas en el ámbito agrario, la importancia de los virus no puede sobreestimarse. Las enfermedades virales de las plantas causan un daño colosal a la agricultura en todo el mundo. Pueden provocar reducciones del rendimiento del 30–50% y, en algunos casos, la pérdida total de la cosecha (Kreuze et al., 2020).

Las enfermedades virales causan daños no solo reduciendo la cantidad, sino también la calidad del producto. Por ejemplo, las infecciones virales pueden hacer que los frutos no sean aptos para la venta o el procesamiento. Además, los virus crean graves problemas para el comercio internacional. Muchos virus son organismos de cuarentena, y su detección en un lote de material de plantación o semillas puede llevar a la prohibición de importación y a la destrucción de todo el lote.

Precisamente por eso la identificación precisa de los virus tiene una importancia práctica crítica. Sin ella no son posibles ni el diagnóstico eficaz (establecer el diagnóstico correcto), ni la certificación del material de plantación (confirmación de su sanidad y pureza), ni el desarrollo de estrategias de cuarentena (prevención de la propagación de patógenos peligrosos) (Blancard, 2012).

En el siguiente capítulo analizaremos en detalle cómo la comunidad científica intenta ordenar esta enorme diversidad de virus mediante el sistema taxonómico oficial: el ICTV.

ICTV: el sistema oficial de clasificación de virus

El ICTV fue creado en 1966 como un comité dependiente de la Unión Internacional de Sociedades Microbiológicas (IUMS). Su tarea principal es el desarrollo y mantenimiento de un esquema taxonómico único y universal para todos los virus, incluidos los viroides y algunos grupos de virus satélite (King et al., 2012). Es precisamente el ICTV el organismo que toma decisiones sobre la creación de nuevos taxones (grupos) y les asigna nombres oficiales. Las decisiones del ICTV son obligatorias para todos los virólogos del mundo, lo que garantiza estabilidad y continuidad en la literatura científica y el diagnóstico práctico.

Principios: sistema jerárquico basado en el genoma, la replicación y la estructura

La taxonomía del ICTV, como cualquier clasificación biológica, es jerárquica. Sin embargo, a diferencia de la clasificación de plantas o animales, donde la base son caracteres morfológicos y evolutivos, la taxonomía de virus se basa en un complejo de características molecular-biológicas. Los criterios principales para asignar un virus a un taxón determinado son:

1. Tipo y estructura del genoma: ADN o ARN, monocatenario o bicatenario, lineal o circular, segmentado o no, polaridad de la cadena (positiva o negativa).

2. Estrategia de replicación: El mecanismo por el cual el virus copia su genoma y sintetiza ARNm. Este criterio está estrechamente relacionado con la clasificación de Baltimore, de la que hablaremos más adelante.

3. Estructura del virión: Presencia o ausencia de envoltura lipídica, tipo de simetría de la cápside (helicoidal, icosaédrica), tamaño y forma de las partículas.

4. Propiedades biológicas: Rango de hospedadores, vías de transmisión, patogenicidad.

La taxonomía moderna del ICTV, reflejada en el noveno informe y los siguientes, incluye los siguientes rangos principales (King et al., 2012):

• Realm (Reino/Dominio): El rango más alto, introducido relativamente hace poco. Agrupa virus que tienen un origen evolutivo común, rastreado por genes "marcadores" conservados, por ejemplo, genes de la replicasa o de la proteína de la cápside. Para 2021 se distinguen varios de estos reinos: Riboviria (todos los virus de ARN y los virus con transcripción inversa), Monodnaviria (virus de ADN monocatenario), Duplodnaviria (virus de ADN bicatenario, incluidos herpesvirus y bacteriófagos) y otros (Koonin, 2021).
• Kingdom (Reino): Rango intermedio introducido para reflejar con mayor precisión las relaciones evolutivas dentro de los grandes reinos.
• Phylum (Filo): Rango que agrupa clases relacionadas.
• Class (Clase): Rango que agrupa órdenes relacionados.
• Order (Orden): Rango que agrupa familias relacionadas. Por ejemplo, el orden Picornavirales agrupa varias familias de pequeños virus de ARN.
• Family (Familia): Rango que agrupa géneros relacionados. Los nombres de las familias siempre se escriben con mayúscula y terminan en -viridae. Por ejemplo, Potyviridae, Tobamoviridae.
• Genus (Género): Rango que agrupa especies estrechamente relacionadas. Los nombres de los géneros también se escriben con mayúscula y terminan en -virus. Por ejemplo, Potyvirus, Tobamovirus.
• Species (Especie): La unidad básica de la taxonomía. Una especie es un grupo de virus que tienen propiedades biológicas similares y un alto nivel de parentesco genético. Los nombres de las especies generalmente no se latinizan, sino que son una frase descriptiva, a menudo con el nombre del hospedador y el síntoma. Por ejemplo, Tobacco mosaic virus (virus del mosaico del tabaco).

Diferencias con la nomenclatura binomial: nombres a menudo descriptivos, no latinizados

La diferencia más importante entre la nomenclatura viral y el sistema binomial clásico de Linneo (género + especie) es que los nombres de los taxones virales no están latinizados. Son либо acrónimos (por ejemplo, CaMV — Cauliflower mosaic virus), либо frases descriptivas en inglés. Como ya hemos señalado, los nombres de familias y géneros están estandarizados por sus terminaciones, pero las raíces de las palabras pueden ser cualesquiera. Esto hace que la nomenclatura viral sea más flexible, pero a veces menos intuitiva para un no especialista.

Ejemplos: Potyvirus, Tobamovirus, Cucumovirus, Closterovirus

Veamos varios géneros clave de virus de plantas que encontrará constantemente en su práctica:

• Potyvirus: El género más grande de la familia Potyviridae. El nombre proviene de Potato virus Y (virus Y de la papa). Son virus filamentosos con genoma de (+)ssRNA, transmitidos por pulgones. Incluye muchos patógenos económicamente importantes, como el virus del mosaico del pepino y el virus de la viruela del ciruelo (Agrios, 2005).
• Tobamovirus: Género de la familia Virgaviridae. El nombre proviene de Tobacco mosaic virus (virus del mosaico del tabaco). Son virus en forma de varilla con genoma de (+)ssRNA, extremadamente estables y transmitidos mecánicamente (por contacto). Además del TMV, aquí se incluye el virus del mosaico del tomate (Agrios, 2005).
• Cucumovirus: Género de la familia Bromoviridae. El nombre proviene de Cucumber mosaic virus (virus del mosaico del pepino). Son virus isométricos con genoma de (+)ssRNA segmentado, transmitidos por pulgones de manera no persistente (Blancard, 2012).
• Closterovirus: Género de la familia Closteroviridae. El nombre proviene del griego "kloster" — hilo, debido a partículas filamentosas muy largas y flexibles. Incluye el virus de la tristeza de los cítricos y el virus de la amarillez de la remolacha. Se transmiten por diversos insectos, con mayor frecuencia pulgones, moscas blancas o cochinillas (Agrios, 2005).

Problemas: evolución rápida, recombinación, cuasiespecies

La clasificación de virus no es un sistema estático, sino un campo en desarrollo dinámico. El ICTV se enfrenta constantemente a graves problemas relacionados con la propia biología de los virus:

• Evolución rápida: Los virus, especialmente los que contienen ARN, tienen una tasa de mutación muy alta debido a la ausencia de sistemas de reparación (corrección de errores) durante la replicación. Esto conduce a la rápida aparición de nuevas cepas y variantes.
• Recombinación: Los virus pueden intercambiar segmentos del genoma, especialmente durante infecciones mixtas. Esto puede dar lugar a virus híbridos con nuevas propiedades, lo que complica aún más su clasificación.
• Cuasiespecies: Debido a la alta tasa de mutación, la población viral en una sola planta no es una molécula homogénea, sino una "nube" de variantes estrechamente relacionadas pero genéticamente distintas, llamada cuasiespecie. Esto difumina los límites entre "especies" en el sentido clásico.

Por eso la taxonomía del ICTV se basa en un complejo de caracteres, y no solo en un gen, y se revisa constantemente.

Por qué la clasificación de Baltimore no es una taxonomía

Para concluir este capítulo, es importante distinguir claramente la taxonomía del ICTV de la clasificación de Baltimore, que analizaremos en detalle más adelante. David Baltimore en 1971 propuso un sistema basado exclusivamente en la estrategia de replicación del genoma y las vías de transferencia de información genética (Koonin, 2021). Dividió todos los virus en siete grupos, por ejemplo, "virus de (+)ssRNA" o "virus de dsDNA".

La clasificación de Baltimore es un sistema funcional, no filogenético. Agrupa los virus según cómo funcionan, no según cuán emparentados están. Por ejemplo, en el grupo de los virus de (+)ssRNA caen virus de líneas evolutivas completamente diferentes, como Potyvirus (filamentoso) y Tobamovirus (en forma de varilla), que no son parientes cercanos. Precisamente por eso la clasificación de Baltimore no es una taxonomía en sentido estricto y no es utilizada por el ICTV como jerarquía principal. Es una herramienta adicional que ayuda a comprender la biología del virus y a elegir métodos para su diagnóstico, pero no sustituye la taxonomía evolutiva.

En el siguiente capítulo analizaremos en detalle cada uno de los siete grupos de la clasificación de Baltimore para entender cómo funcionan estas estrategias de replicación y por qué son tan importantes para la práctica.

Siete grupos: dsDNA, ssDNA, dsRNA, (+)ssRNA, (−)ssRNA, ssRNA-RT, dsDNA-RT

Baltimore dividió todos los virus conocidos en siete grupos según el tipo de su genoma y la forma en que este genoma se traduce en ARNm. Consideremos cada uno de ellos.

1. Grupo I: virus de ADN bicatenario (dsDNA). Son virus cuyo genoma está representado por ADN bicatenario. Su replicación y transcripción siguen la misma vía clásica que en las células: ADN → ARN → proteína. A este grupo pertenecen muchos bacteriófagos, así como virus que infectan animales (por ejemplo, herpesvirus) y plantas. Entre los fitopatógenos, son principalmente virus de la familia Caulimoviridae, como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), y los badnavirus, por ejemplo, el virus del rayado del banano (Agrios, 2005; Koonin, 2021).

2. Grupo II: virus de ADN monocatenario (ssDNA). El genoma de estos virus está representado por ADN monocatenario. Para la replicación y transcripción, primero deben sintetizar una cadena complementaria, formando un intermediario de ADN bicatenario, que luego se utiliza para la síntesis de ARNm. La mayoría de los virus de plantas de ssDNA conocidos pertenecen a la familia Geminiviridae. Son virus con partículas "gemelas" características, como el virus de la amarillez de la remolacha, el virus del mosaico de la yuca africana y el virus del rizado amarillo del tomate (Agrios, 2005; Koonin, 2021).

3. Grupo III: virus de ARN bicatenario (dsRNA). El genoma de estos virus consiste en ARN bicatenario. Dado que las células no tienen enzimas para la síntesis de ARN sobre una matriz de ARN, estos virus deben llevar su propia ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) en el virión. Este grupo incluye virus que infectan hongos, plantas y animales. En plantas, son, por ejemplo, virus del género Phytoreovirus (virus del enanismo del arroz) y Fijivirus (virus del enanismo rayado negro del arroz) (Agrios, 2005; Koonin, 2021).

4. Grupo IV: virus con ARN monocatenario positivo ((+)ssRNA). Es el grupo más numeroso de virus y, probablemente, el más importante desde el punto de vista de la fitopatología. Su genoma es ARN monocatenario de polaridad positiva, lo que significa que puede traducirse directamente por los ribosomas de la célula hospedadora, como un ARNm normal. El virión no necesita enzimas propias para la primera traducción. A este grupo pertenece la inmensa mayoría de los virus de plantas, incluidos géneros tan importantes como Potyvirus, Tobamovirus, Cucumovirus, Closterovirus, Luteovirus, Polerovirus y muchos otros (Agrios, 2005; Koonin, 2021).

5. Grupo V: virus con ARN monocatenario negativo ((−)ssRNA). El genoma de estos virus está representado por ARN monocatenario de polaridad negativa, que es complementario al ARNm. Esto significa que no puede traducirse directamente. El virus debe primero sintetizar sobre su base una cadena de (+)ARN, que servirá como matriz para la síntesis de proteínas virales. Para ello, el virión debe contener su propia RdRp. A este grupo pertenecen virus de la familia Rhabdoviridae (por ejemplo, el virus del enanismo amarillo de la papa) y Bunyaviridae (por ejemplo, el virus del bronceado del tomate, TSWV) (Agrios, 2005; Koonin, 2021).

6. Grupo VI: virus con transcripción inversa y genoma de ARN (ssRNA-RT). Son virus cuyo genoma está representado por ARN monocatenario, pero su replicación pasa por una etapa de síntesis de ADN utilizando la enzima transcriptasa inversa (RT). El ARN viral primero se retrotranscribe a ADN, que luego se integra en el genoma del hospedador o se utiliza para sintetizar nuevas moléculas de ARN. A este grupo pertenecen los retrovirus (por ejemplo, el VIH) y los metavirus (antes conocidos como retrotransposones similares a Ty3/gypsy), que pueden comportarse como virus (Koonin, 2021).

7. Grupo VII: virus con transcripción inversa y genoma de ADN (dsDNA-RT). El genoma de estos virus es ADN bicatenario, pero su replicación también utiliza la transcriptasa inversa. El ADN viral se transcribe a ARN, que luego sirve como matriz para la transcripción inversa a nuevo ADN. Es una vía inusual que no se encuentra en las células. A este grupo pertenecen virus de la familia Hepadnaviridae (por ejemplo, el virus de la hepatitis B) y, lo que es importante para nosotros, Caulimoviridae (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor) (Koonin, 2021).

Conveniencia para la práctica, pero no refleja el parentesco evolutivo

¿Por qué es tan popular la clasificación de Baltimore, a pesar de que no es una taxonomía oficial? La respuesta es simple: es extremadamente conveniente para la práctica. Sabiendo a qué grupo pertenece un virus, el investigador obtiene inmediatamente información clave:

• Qué enzimas buscar en el virión: Por ejemplo, si sabe que un virus pertenece al grupo V ((−)ssRNA), buscará en su composición ARN polimerasa dependiente de ARN, porque sin ella no podrá iniciar la replicación. Si es un virus del grupo IV ((+)ssRNA), la presencia de tal polimerasa en el virión no es obligatoria, aunque puede estar.
• Cómo entra el virus en la célula y qué hace allí: La estrategia de replicación determina directamente si el virus se integrará en el genoma del hospedador (como los retrovirus) o permanecerá en el citoplasma (como la mayoría de los virus de ARN).
• Cómo diagnosticarlo: Para diferentes grupos de virus, los métodos óptimos de diagnóstico pueden diferir. Por ejemplo, para virus con genoma de ADN (grupos I, II, VII) se puede usar PCR con matriz de ADN, mientras que para los que contienen ARN (grupos III, IV, V, VI) se necesita una reacción previa de transcripción inversa (RT-PCR).

Ejemplo: los virus de (+)ssRNA incluyen familias diferentes no relacionadas entre sí

La principal desventaja de la clasificación de Baltimore como sistema taxonómico es que no refleja el parentesco evolutivo. El ejemplo más claro es el grupo IV, virus de (+)ssRNA. En él caen virus de familias completamente diferentes y no relacionadas entre sí. Por ejemplo:

• Potyvirus (familia Potyviridae) — virus filamentosos transmitidos por pulgones.
• Tobamovirus (familia Virgaviridae) — virus en forma de varilla transmitidos por contacto.
• Cucumovirus (familia Bromoviridae) — virus isométricos con genoma segmentado, transmitidos por pulgones.
• Closterovirus (familia Closteroviridae) — virus filamentosos muy largos, transmitidos por diversos insectos.

Todos estos virus están unidos por una sola característica común: su genoma es (+)ssRNA. Pero evolutivamente están tan distantes entre sí que su unificación en un solo grupo no tiene ningún sentido filogenético. Adquirieron independientemente una estrategia de replicación similar, pero su origen es diferente.

Relación con el ICTV: una herramienta adicional que no sustituye la taxonomía

Así, la clasificación de Baltimore y la taxonomía del ICTV son dos herramientas complementarias, pero fundamentalmente diferentes.

• El ICTV responde a la pregunta "¿quién es?" y "¿con quién está emparentado?". Es un sistema evolutivo, filogenético. Es importante para comprender el origen de los virus, sus relaciones de parentesco y para desarrollar estrategias de obtención de variedades resistentes.
• La clasificación de Baltimore responde a la pregunta "¿cómo funciona?". Es un sistema funcional que describe el mecanismo molecular de replicación. Es indispensable para el diagnóstico, la comprensión de la patogénesis y la elección de métodos de control.

En el trabajo práctico, especialmente en el ámbito de la protección de plantas, es necesario dominar ambos enfoques. Sabiendo que un virus pertenece al género Potyvirus (ICTV), usted entiende que probablemente es un virus filamentoso transmitido por pulgones. Sabiendo que pertenece al grupo IV (+)ssRNA (Baltimore), usted entiende que para su diagnóstico necesitará un método basado en la amplificación de ARN (por ejemplo, RT-PCR).

En el siguiente capítulo examinaremos en detalle los principales géneros de virus de plantas, sus genomas, vectores, síntomas e importancia económica, combinando los conocimientos obtenidos de ambos sistemas de clasificación.

Potyvirus (familia Potyviridae)

Potyvirus es el género más grande de virus de plantas, con más de 90 especies confirmadas y unas 90 putativas. El nombre del género proviene del virus Y de la papa (Potato virus Y, PVY), que es la especie tipo. Estos virus causan un daño colosal a muchos cultivos en todo el mundo.

Genoma y estructura: Los potyvirus tienen un genoma en forma de una sola molécula de (+)ssRNA de aproximadamente 10 kb. Los viriones son partículas filamentosas largas y flexibles de 11–15 nm de diámetro y 680–900 nm de longitud (Agrios, 2005). Una característica distintiva es la formación de inclusiones cilíndricas (similares a molinetes) en el citoplasma de las células infectadas, lo que constituye un signo diagnóstico (Agrios, 2005).

Vectores: Se transmiten de manera no persistente por pulgones. Para la transmisión se requiere la proteína del componente auxiliar viral (HC-Pro), que se une a la proteína de la cápside y asegura la fijación del virus al estilete del pulgón (Agrios, 2005).

Síntomas: Causan mosaico, moteado, clorosis, deformación de hojas y frutos, necrosis, enanismo. Los síntomas varían mucho según el virus, la cepa y la planta hospedadora.

Importancia económica: Incluye muchos patógenos destructivos, como:

• Virus Y de la papa (PVY): Uno de los virus más peligrosos de la papa, que causa mosaico, necrosis de los tubérculos y pérdidas significativas de rendimiento.
• Virus del mosaico del pepino (CMV): Aunque el CMV pertenece a otro género (Cucumovirus), los potyvirus también incluyen virus que afectan al pepino, por ejemplo, el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV).
• Virus de la viruela del ciruelo (PPV): Organismo de cuarentena que causa graves enfermedades en frutales de hueso (ciruelo, melocotonero, albaricoquero), provocando deformación y caída de frutos (Blancard, 2012).
• Virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV) y virus del mosaico enanizante del maíz (MDMV).
• Virus del mosaico común de la judía (BCMV).

Tobamovirus (familia Virgaviridae)

Tobamovirus — género nombrado en honor al virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus, TMV). Es uno de los virus más estudiados en la historia de la biología.

Genoma y estructura: El genoma está representado por una sola molécula de (+)ssRNA de aproximadamente 6,4 kb. Los viriones son partículas rígidas en forma de varilla de 18 nm de diámetro y 300–310 nm de longitud (Agrios, 2005). Las partículas virales son extremadamente estables y pueden conservar la infectividad durante muchos años en restos vegetales secos, en semillas e incluso en productos de tabaco.

Vectores: No tienen vectores biológicos. Se propagan mecánicamente — por contacto entre plantas, a través de las manos y herramientas de los trabajadores, así como con las semillas (Agrios, 2005).

Síntomas: Causan mosaico, moteado, deformación de hojas (a veces hasta filiformidad), enanismo. En los frutos pueden aparecer anillos necróticos y oscurecimiento interno.

Importancia económica: El TMV infecta tabaco, tomates, pimientos y muchas otras solanáceas. El virus del mosaico del tomate (ToMV) — un pariente muy cercano del TMV, causa graves pérdidas en explotaciones de invernadero. También se incluye aquí el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (CGMMV), que afecta a cultivos de cucurbitáceas.

Cucumovirus (familia Bromoviridae)

Cucumovirus — género cuya especie tipo es el virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV). Es uno de los virus más extendidos y dañinos del mundo.

Genoma y estructura: El genoma es segmentado y consta de tres moléculas de (+)ssRNA. Los viriones son partículas isométricas de aproximadamente 29 nm de diámetro (Agrios, 2005). El CMV tiene un rango de hospedadores muy amplio, infectando más de 1200 especies de plantas, incluidas hortalizas, frutales, cultivos ornamentales y malas hierbas.

Vectores: Se transmite por más de 80 especies de pulgones de manera no persistente. También puede transmitirse mecánicamente y con semillas de algunos cultivos.

Síntomas: Causa mosaico, deformación de hojas (a veces hasta filiformidad o "acordonamiento"), enanismo de las plantas, necrosis. En los frutos de pepino pueden aparecer áreas blancas, lo que los hace no aptos para la venta (Blancard, 2012).

Importancia económica: El CMV causa un enorme daño a la horticultura, especialmente a pepinos, tomates, pimientos, lechuga y muchos otros cultivos. El virus también afecta a muchas plantas florales.

Closterovirus (familia Closteroviridae)

Closterovirus — género cuyo nombre proviene del griego "kloster" (hilo), lo que refleja la morfología de los viriones. La especie tipo es el virus de la amarillez de la remolacha (Beet yellows virus, BYV).

Genoma y estructura: Son los virus de plantas más largos. Su genoma es una molécula de (+)ssRNA de 14,5–19,3 kb. Los viriones son partículas filamentosas muy largas y flexibles de 1350–2000 nm de longitud y 12 nm de diámetro (Agrios, 2005). Contienen una "cola" única en un extremo, formada por una proteína minoritaria de la cápside.

Vectores: Se transmiten de forma semipersistente por diversos insectos: pulgones, moscas blancas, cochinillas y escamas, según la especie de virus (Agrios, 2005).

Síntomas: Causan amarillez (clorosis), enrollamiento de hojas, enanismo, necrosis del floema. A menudo afectan solo el floema, lo que dificulta el diagnóstico.

Importancia económica: Incluye patógenos tan importantes como:

• Virus de la tristeza de los cítricos (CTV): Uno de los virus más peligrosos de los cítricos, que causa la muerte rápida de árboles injertados sobre portainjertos susceptibles (por ejemplo, naranjo amargo). Se transmite por pulgones.
• Virus de la amarillez de la remolacha (BYV): Afecta a la remolacha azucarera, causando pérdidas significativas de rendimiento y sacarosa. Se transmite por pulgones.
• Virus asociados al enrollamiento de la vid (GLRaV): Afectan a viñedos de todo el mundo.

Otros géneros importantes de virus de plantas

Además de los enumerados anteriormente, existen otros géneros que merecen mención en nuestro curso.

• Luteovirus (familia Luteoviridae): Nombre del latín "luteus" (amarillo). Especie tipo — virus del enanismo amarillo de la cebada (Barley yellow dwarf virus, BYDV). Genoma — (+)ssRNA. Viriones — isométricos. Se transmiten persistentemente (circulativamente) por pulgones. Causan amarillez, enanismo, enrollamiento de hojas. Afectan a cereales, causando graves daños.
• Polerovirus (familia Luteoviridae): Nombre de Potato leafroll virus (virus del enrollamiento de la papa, PLRV). También se transmiten persistentemente por pulgones. Viriones isométricos. Además del PLRV, aquí se incluyen el virus de la amarillez occidental de la remolacha (BWYV) y el virus de la amarillez transmitido por pulgones de las cucurbitáceas (CABYV). Causan amarilleamiento, enrollamiento de hojas, inhibición del crecimiento.
• Geminivirus (familia Geminiviridae): Nombre del latín "gemini" (gemelos), ya que los viriones consisten en dos partículas icosaédricas fusionadas. Genoma — ssDNA (Grupo II de Baltimore). Es la única familia de virus de plantas con tal genoma que consideraremos. Se transmiten por moscas blancas (género Begomovirus) o saltahojas (géneros Curtovirus, Mastrevirus). Causan enfermedades muy graves, especialmente en regiones tropicales y subtropicales: virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV), virus del mosaico de la yuca africana (ACMV), virus del mosaico dorado de la judía (BGMV). Síntomas característicos: rizado de hojas, mosaico amarillo, enanismo.
• Tospovirus (familia Bunyaviridae): Nombre de Tomato spotted wilt virus (virus del bronceado del tomate, TSWV). Es el único grupo de virus de plantas con genoma de (−)ssRNA (Grupo V de Baltimore) y envoltura lipídica. Viriones esféricos, de 80–110 nm de diámetro. Se transmiten por trips de manera persistente, propagativa (el virus se multiplica en el cuerpo del vector). Causan enfermedades muy peligrosas: bronceado, necrosis, manchas anulares en hojas y frutos, bronceado. Afectan a tomates, pimientos, tabaco, así como a muchos cultivos ornamentales.
• Ilarvirus (familia Bromoviridae): Nombre de "isometric labile ringspot viruses". Genoma — (+)ssRNA, segmentado. Viriones isométricos, pero a menudo pleomórficos (de forma variable). Se transmiten por polen y semillas, y por algunas especies de trips. Causan manchas anulares, mosaico, necrosis en frutales de hueso y pepita, rosas, lúpulo. Un representante típico es el virus de las manchas anulares necróticas de los frutales de hueso (PNRSV).

En el siguiente capítulo pasaremos a un grupo completamente especial de patógenos: los viroides, que son aún más pequeños que los virus y no tienen cubierta proteica.

Descubrimiento: PSTVd (potato spindle tuber viroid)

La historia del descubrimiento de los viroides es un ejemplo clásico de curiosidad científica. En 1971, el fitopatólogo estadounidense Theodor Diener estudiaba el agente causal de la enfermedad del tubérculo fusiforme de la papa (potato spindle tuber disease). Descubrió que la infectividad se conservaba incluso después de tratar la preparación con enzimas que destruyen proteínas y después de la extracción con fenol, que elimina las proteínas. Además, el agente era tan pequeño que pasaba a través de filtros que retienen todos los virus conocidos. Diener llegó a la conclusión de que el agente causal no era un virus, sino un ARN libre de bajo peso molecular, al que llamó viroide (de "virus" y "oide" — similar) (Agrios, 2005). Así se descubrió el viroide del tubérculo fusiforme de la papa (Potato spindle tuber viroid, PSTVd) — el primer representante de este grupo.

Estructura

Los viroides son moléculas de ARN monocatenario y circular de solo 250 a 400 nucleótidos de longitud. Para comparación: el genoma del virus más pequeño tiene unos 1700 nucleótidos de longitud (Agrios, 2005). Debido a una longitud tan corta, los viroides no codifican ninguna proteína. Toda su "información" es la secuencia de nucleótidos, que determina su capacidad de replicación y su patogenicidad.

La molécula de ARN del viroide tiene una estructura en forma de varilla, que se forma por el apareamiento de bases entre regiones complementarias de la misma cadena. Esta estructura hace que el ARN del viroide sea muy estable y resistente a la acción de enzimas (ribonucleasas) y altas temperaturas (Agrios, 2005; Blancard, 2012).

En la estructura del viroide se distinguen varios dominios funcionales (Blancard, 2012):

• Región central conservada: La más similar entre todos los viroides.
• Regiones terminales (izquierda y derecha): Responsables de la replicación.
• Región patogénica: Determina la gravedad de los síntomas. El cambio de solo uno o dos nucleótidos en esta región puede convertir una cepa leve en una altamente virulenta.
• Región variable: La menos conservada.

Replicación: mediante la ARN polimerasa del hospedador

Dado que los viroides no codifican enzimas propias, para su replicación se utiliza la ARN polimerasa II del hospedador — una enzima que normalmente sintetiza ARNm sobre una matriz de ADN (Agrios, 2005). Es un caso único en el que una enzima destinada a trabajar con ADN es "engañada" para que trabaje con una matriz de ARN.

El proceso de replicación del viroide ocurre por el mecanismo de círculo rodante (rolling circle) e incluye las siguientes etapas (Agrios, 2005):

1. Síntesis de la cadena (−): La ARN polimerasa del hospedador sintetiza una cadena de ARN (−) complementaria, utilizando la cadena original (+) del viroide como matriz. En este proceso se forma una cadena (−) lineal, larga y multimérica.

2. Síntesis de la cadena (+): La cadena (−) multimérica sirve como matriz para la síntesis de una cadena (+) de ARN multimérica.

3. Corte y ligadura: Enzimas específicas del hospedador cortan las cadenas multiméricas en monómeros (copias individuales del viroide) y las circularizan.

Es interesante que los viroides se replican en diferentes compartimentos celulares según la familia: Pospiviroidae — en el núcleo (nucléolo), y Avsunviroidae — en los cloroplastos (Koonin, 2021).

Sistemática: familias Pospiviroidae, Avsunviroidae

La taxonomía moderna de los viroides, según el ICTV, se basa en la estructura del genoma y el modo de replicación. Se distinguen dos familias (King et al., 2012; Blancard, 2012):

1. Familia Pospiviroidae: A esta familia pertenece la mayoría de los viroides conocidos, incluido el PSTVd. Se caracterizan por la presencia de una región central conservada y se replican en el núcleo. El nombre proviene del género tipo Pospiviroid (Potato spindle tuber viroid).

2. Familia Avsunviroidae: Un grupo pequeño de viroides que no tienen una región central conservada y poseen la capacidad de autocorte (actividad ribozímica). Se replican en los cloroplastos. El género tipo es Avsunviroid (Avocado sunblotch viroid).

Géneros: Pospiviroid, Hostuviroid, Cocadviroid, Apscaviroid, Coleviroid

Dentro de la familia Pospiviroidae se distinguen varios géneros, cuyos nombres reflejan либо el hospedador, либо el síntoma (Blancard, 2012):

• Pospiviroid: Género tipo, que incluye el PSTVd, así como el viroide de la exocortis de los cítricos (Citrus exocortis viroid, CEVd) y el viroide del enanismo del crisantemo (Chrysanthemum stunt viroid, CSVd).
• Hostuviroid: Nombre de Hop stunt viroid (viroide del enanismo del lúpulo).
• Cocadviroid: Nombre de Coconut cadang-cadang viroid (viroide del cadang-cadang del cocotero).
• Apscaviroid: Nombre de Apple scar skin viroid (viroide de la piel cicatricial de la manzana).
• Coleviroid: Nombre de Coleus blumei viroid (viroide del cóleo).

En la familia Avsunviroidae se distinguen los géneros Avsunviroid (viroide del manchado solar del aguacate), Pelamoviroid (viroide del moteado clorótico del crisantemo) y Elaviroid (viroide del mosaico latente del melocotonero).

Enfermedades: tubérculo fusiforme de la papa, exocortis de los cítricos, enanismo del crisantemo

Los viroides causan toda una serie de enfermedades económicamente significativas. Consideremos las más importantes.

• Tubérculo fusiforme de la papa (PSTVd): Afecta a la papa y al tomate. En la papa, las plantas se vuelven erectas, fusiformes, las hojas pequeñas, los tubérculos se alargan, se vuelven fusiformes y su rendimiento cae bruscamente (Blancard, 2012). El viroide se transmite mecánicamente al cortar los tubérculos, así como con el polen y las semillas. Es una de las enfermedades más peligrosas de la papa.
• Exocortis de los cítricos (CEVd): Afecta a los cítricos, especialmente sensibles son el trifoliado y el citrange. En el portainjerto se desarrolla un característico desprendimiento escamoso de la corteza (scaly bark), lo que provoca inhibición del crecimiento y reducción del rendimiento. El viroide se transmite por injerto y con herramientas (Blancard, 2012).
• Enanismo del crisantemo (CSVd): Causa retraso del crecimiento, deformación de flores y hojas, lo que hace que las flores no sean aptas para la venta. Se transmite con esquejes y herramientas (Blancard, 2012).
• Cadang-cadang del cocotero (CCCVd): Una de las enfermedades más terribles de las palmeras cocoteras en Filipinas. Provoca la muerte gradual de las hojas, reducción del rendimiento y muerte del árbol. Se transmite mecánicamente y, posiblemente, con el polen (Agrios, 2005).

Transmisión: mecánica, semillas, polen, material vegetativo

A diferencia de los virus, los viroides no tienen vectores específicos (insectos, nematodos, hongos). Se propagan por las siguientes vías (Agrios, 2005; Blancard, 2012):

• Transmisión mecánica: La vía más común. Los viroides se transmiten por contacto entre plantas, a través de las manos, herramientas (cuchillos para cortar tubérculos, tijeras de podar), ropa.
• Propagación vegetativa: Cualquier material de plantación (tubérculos, esquejes, bulbos, rizomas) tomado de una planta infectada contendrá el viroide.
• Semillas y polen: Muchos viroides se transmiten con semillas y polen, aunque el porcentaje de transmisión puede ser bajo.
• Otras vías: En casos raros, es posible la transmisión por pulgones (solo en complejo con un virus auxiliar) y a través del suelo infectado.

Importancia práctica: cuarentena, certificación, diagnóstico

Los viroides tienen una enorme importancia práctica para la agricultura, y su identificación precisa es críticamente importante.

Cuarentena: Muchos viroides (por ejemplo, PSTVd, CEVd, CCCVd) son organismos de cuarentena. Su detección en un lote de semillas o material de plantación conlleva la destrucción de todo el lote.

Certificación: Los programas de certificación de material de plantación (especialmente papa, cítricos, frutales) incluyen obligatoriamente pruebas de viroides.

Diagnóstico: Dado que los viroides no tienen cubierta proteica, los métodos serológicos (ELISA) no funcionan para su detección. Métodos principales de diagnóstico:

• Biológico: Inoculación de plantas indicadoras (por ejemplo, tomates para PSTVd).
• Electroforesis: Electroforesis de retorno en PAGE, que permite separar ARN circulares y lineales.
• Métodos moleculares: RT-PCR e hibridación de ADN son los métodos más sensibles y fiables. Para ello es necesario aislar el ARN y realizar la transcripción inversa seguida de amplificación (Blancard, 2012).

En el siguiente capítulo examinaremos con más detalle la importancia práctica de la identificación precisa de virus y viroides para el diagnóstico, la certificación y la cuarentena.

Diagnóstico: elección del método

La primera y más evidente aplicación de la identificación precisa es el diagnóstico. Sin embargo, la elección del método diagnóstico no es arbitraria. Está determinada directamente por las propiedades biológicas del patógeno presunto, su título en la planta, la presencia de infecciones mixtas y los recursos disponibles en el laboratorio (Blancard, 2012).

Los principales métodos de diagnóstico de virus y viroides pueden dividirse en varios grupos.

1. Métodos biológicos (plantas indicadoras). Enfoque clásico en el que el jugo de la planta presuntamente enferma se inocula en un conjunto determinado de plantas indicadoras. Por el carácter de los síntomas (necrosis locales, mosaico, manchas anulares) puede identificarse con alta probabilidad el virus. Este método es laborioso, requiere mucho tiempo e instalaciones de invernadero, pero sigue siendo insustituible para detectar virus desconocidos o nuevos, así como para la tipificación biológica de cepas (Agrios, 2005; Blancard, 2012).

2. Métodos serológicos. El más extendido es el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), en particular sus modificaciones (DAS-ELISA, ELISA indirecto). El método se basa en la unión específica de la proteína viral (antígeno) con anticuerpos. El ELISA es de alto rendimiento, relativamente económico y permite analizar miles de muestras. Sin embargo, no funciona para los viroides, que carecen de cubierta proteica, y puede dar resultados falsos negativos con títulos virales bajos o con una alta variabilidad genética de las cepas (Agrios, 2005; Blancard, 2012).

3. Métodos moleculares. Se basan en la detección del ácido nucleico del patógeno. Para los virus con ARN y los viroides, la etapa obligatoria es la transcripción inversa (RT) seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También se han desarrollado métodos de RT-PCR en tiempo real (qPCR), que permiten no solo detectar el virus sino también cuantificar su concentración. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es otro método prometedor, que no requiere equipos complejos y es apto para condiciones de campo (Kreuze et al., 2020; Jeger et al., 2023). Los métodos moleculares poseen la mayor sensibilidad y especificidad; son insustituibles para el diagnóstico de viroides y de infecciones latentes.

4. Secuenciación. Con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS) surgió la posibilidad no solo de detectar virus conocidos, sino también de descubrir nuevos, así como de analizar cuasiespecies y formas recombinantes. La HTS se está convirtiendo en el estándar de oro para el cribado virológico y el análisis filogenético (Kreuze et al., 2020; Koonin, 2021). Sin embargo, su aplicación está limitada por el coste y la necesidad de procesamiento bioinformático de los datos.

5. Diagnóstico CRISPR. En los últimos años se están desarrollando activamente sistemas basados en CRISPR-Cas que, combinados con la amplificación isotérmica, permiten una detección altamente sensible y específica de ácidos nucleicos, incluidos los virus de plantas. Estas tecnologías se encuentran todavía en fase de desarrollo experimental, pero en el futuro pueden convertirse en una potente herramienta para el diagnóstico de campo (Jeger et al., 2023).

Problemas del diagnóstico. Incluso con métodos modernos, la identificación precisa puede verse dificultada por varios factores: título bajo del virus en la planta (especialmente en las etapas tempranas de la infección), infecciones latentes (cuando el virus está presente pero no hay síntomas), infecciones mixtas (una planta puede estar infectada simultáneamente por varios virus, lo que distorsiona los síntomas y dificulta la interpretación de los resultados), así como la alta variabilidad genética (cuasiespecies y recombinantes). Precisamente por eso, para una identificación fiable a menudo se requiere un enfoque integral: la combinación de métodos biológicos, serológicos y moleculares (Blancard, 2012; Jeger et al., 2023).

Certificación: material de plantación, semillas, clones

La segunda aplicación clave de la identificación precisa es la certificación. Para muchos cultivos, especialmente los de multiplicación vegetativa (papa, frutales, bayas, ornamentales), el uso de material de plantación sano es la base del rendimiento y la calidad. La certificación es un procedimiento oficial que confirma que el material de plantación cumple determinados estándares de sanidad, pureza varietal y calidad (Le Hingrat and Quéré, 2023).

La certificación comprende varias etapas:

• Inspecciones de campo con evaluación visual de las plantas en busca de síntomas.
• Análisis de laboratorio (ELISA, PCR) para detectar infecciones latentes.
• Post-control (cultivo de la descendencia en condiciones protegidas para verificar la sanidad).
• Multiplicación clonal del material inicial libre de patógenos (Caliskan et al., 2023; Le Hingrat and Quéré, 2023).

Por ejemplo, en la producción de semillas de papa, la certificación comienza con la obtención de plantas libres de virus in vitro (cultivo de tejidos), luego se realiza la multiplicación en suelo protegido (minitubérculos) y solo después se pasa a las generaciones de campo con un control estricto de la infección. La identificación precisa de los virus (especialmente el virus Y de la papa, el virus del enrollamiento de la hoja y el viroide del tubérculo fusiforme) en cada etapa permite descartar los clones infectados y evitar la propagación de patógenos (Le Hingrat and Quéré, 2023). Para los frutales, como el manzano, el peral y el ciruelo, la certificación se basa en la indexación: el injerto de yemas o estaquillas en plantas indicadoras, así como en el análisis molecular (Blancard, 2012).

Cuarentena: listas A1, A2, prohibición de importación

La tercera aplicación, no menos importante, de la identificación precisa es la cuarentena. Muchos virus y viroides son objetos de cuarentena, es decir, su importación y propagación en el territorio de un país o región están prohibidas o estrictamente limitadas. Las listas de cuarentena (por ejemplo, A1 — ausentes en el territorio, A2 — de distribución limitada) se elaboran sobre la base de datos científicos sobre la nocividad, las vías de propagación y la posibilidad de aclimatación del patógeno (Le Hingrat and Quéré, 2023; Caliskan et al., 2023).

La identificación precisa permite:

• Prevenir la importación de material infectado. Por ejemplo, el viroide cadang-cadang del cocotero, el virus de la viruela del ciruelo y el virus de la tristeza de los cítricos están incluidos en las listas de cuarentena de muchos países.
• Adoptar medidas al detectar un foco: destrucción de plantas, zona de cuarentena, prohibición de exportación de productos.
• Emitir un certificado fitosanitario para los productos exportados, que confirme su conformidad con los requisitos del país importador (Le Hingrat and Quéré, 2023).

Selección: variedades resistentes, construcciones transgénicas

La cuarta aplicación es la selección para resistencia. El conocimiento de la pertenencia taxonómica precisa del virus y de sus propiedades biológicas (por ejemplo, el mecanismo de transmisión, el círculo de hospedadores, la variabilidad) es necesario para la creación dirigida de variedades resistentes. Los fitomejoradores utilizan genes de resistencia, frecuentemente procedentes de parientes silvestres de las plantas cultivadas. Por ejemplo, el gen Sw-5 de Lycopersicon peruvianum confiere resistencia del tomate al virus del marchitamiento manchado (TSWV), y el gen Ry de Solanum stoloniferum, al virus Y de la papa (Agrios, 2005). La identificación precisa de las cepas y razas del virus permite evaluar la eficacia de estos genes y predecir su superación.

Además, los métodos de ingeniería genética permiten crear plantas transgénicas que expresan genes del virus (por ejemplo, el gen de la proteína de la cápside) para inducir la resistencia derivada del patógeno. Este enfoque, conocido como protección cruzada o interferencia de ARN, requiere el conocimiento preciso de la secuencia del genoma del virus (Agrios, 2005; Jeger et al., 2023). Por ejemplo, las calabazas transgénicas resistentes al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) se crearon precisamente sobre la base de la secuencia del gen de la proteína de la cápside.

Predicción de epidemias: conocimiento de vectores y reservorios

La quinta aplicación es la predicción de epidemias. La identificación precisa del virus y de su vector (pulgones, trips, moscas blancas, nematodos, hongos) permite construir modelos de propagación de la infección y desarrollar medidas de protección oportunas. Por ejemplo, saber que el virus Y de la papa se transmite por pulgones de manera no persistente, mientras que el virus del enrollamiento de la hoja de la papa lo hace de manera persistente, determina estrategias de control diferentes: en el primer caso los insecticidas son poco eficaces, mientras que en el segundo pueden ser eficaces (Jeger et al., 2023; Kreuze et al., 2020). El conocimiento de los reservorios del virus (malas hierbas, plantas silvestres, plantas voluntarias) permite planificar las rotaciones de cultivos y las medidas fitosanitarias.

Biocontrol: virus como agentes contra plagas (visión general)

Finalmente, los virus pueden utilizarse no solo como objeto de control, sino también como agentes de biocontrol. Se trata de los baculovirus, que infectan a insectos plaga y son seguros para los insectos útiles, los animales y el ser humano. Los preparados a base de baculovirus se emplean para el control de orugas de lepidópteros (por ejemplo, noctuidos, polillas de la fruta). La identificación precisa del virus agente y de su hospedador es críticamente importante para la aplicación eficaz y segura de tales biopesticidas (Agrios, 2005). Además, existe el enfoque de la protección cruzada, en el que las plantas se inoculan con una cepa débil del virus para protegerlas de una cepa grave del mismo virus. Este método requiere la identificación precisa de las cepas y de su interacción (Agrios, 2005).

Así, la identificación precisa de virus y viroides no es un ejercicio académico, sino una necesidad imperiosa para todo el sistema de protección de plantas. Constituye la base del diagnóstico, la certificación, la cuarentena, la selección y la predicción de epidemias. Sin ella es imposible tanto la gestión eficaz de los riesgos fitosanitarios como la producción sostenible de productos agrícolas.

En el siguiente capítulo examinaremos con más detalle los métodos de diagnóstico de virus y viroides, sus posibilidades y limitaciones.

Métodos biológicos

Los métodos biológicos, o indexación, constituyen el enfoque históricamente primero y que aún no ha perdido su valor. Se basa en la inoculación del jugo de la planta presuntamente enferma en un conjunto determinado de plantas indicadoras. Cada virus causa en determinadas indicadoras síntomas característicos: necrosis locales, manchas anulares, mosaico, deformación de las hojas (Agrios, 2005; Blancard, 2012).

Ventajas del método biológico:

• Universalidad: permite detectar virus desconocidos o nuevos, para los que no existen anticuerpos ni cebadores diagnósticos.
• Tipificación biológica: ayuda a diferenciar cepas del virus por su patogenicidad y síntomas.
• Accesibilidad: no requiere equipos complejos, aunque sí instalaciones de invernadero y tiempo.

Desventajas:

• Duración: los resultados pueden aparecer después de varias semanas.
• Laboriosidad: requiere mantener una colección de plantas indicadoras.
• Subjetividad: la interpretación de los síntomas depende de la experiencia del investigador.

El método biológico sigue siendo insustituible para el cribado primario y el estudio de nuevos patógenos (Agrios, 2005).

Métodos serológicos

Los métodos serológicos se basan en la interacción específica «antígeno-anticuerpo». La proteína viral (antígeno) se une a los anticuerpos obtenidos mediante inmunización de animales (conejos, ratones). El más extendido es el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), en particular el DAS-ELISA (sándwich de doble anticuerpo) y el ELISA indirecto (Agrios, 2005; Blancard, 2012).

Principio del DAS-ELISA:

1. Los pocillos de la microplaca se recubren con anticuerpos contra el virus.

2. Se añade la muestra de jugo de la planta. Si el virus está presente, se une a los anticuerpos.

3. Se añaden anticuerpos contra el virus conjugados con una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina).

4. Se añade el sustrato, que la enzima transforma en un producto coloreado.

5. La intensidad del color es proporcional a la concentración del virus.

Ventajas del ELISA:

• Alto rendimiento: permite analizar cientos y miles de muestras simultáneamente.
• Cuantificación: permite estimar la concentración del virus.
• Simplicidad y rapidez: resultados en pocas horas.
• Economicidad: método relativamente económico.

Desventajas:

• No funciona para los viroides: carecen de cubierta proteica, por lo que no se forman anticuerpos contra ellos.
• Resultados falsos negativos: posibles con títulos virales bajos, en las etapas tempranas de la infección o con alta variabilidad genética (cuasiespecies).
• Reacciones cruzadas: posibles con virus cercanamente emparentados.

Los métodos serológicos siguen siendo una herramienta rutinaria para el análisis masivo, especialmente en los programas de certificación (Blancard, 2012).

Métodos moleculares

Los métodos moleculares se basan en la detección del ácido nucleico del patógeno (ARN o ADN). Poseen la mayor sensibilidad y especificidad y son insustituibles para el diagnóstico de viroides e infecciones latentes.

1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus modificaciones.

Para los virus con ARN y los viroides, la etapa obligatoria es la transcripción inversa (RT): síntesis de ADN complementario (ADNc) sobre la matriz de ARN. Luego se realiza la amplificación con cebadores específicos. La RT-PCR permite detectar incluso moléculas individuales de ARN viral (Kreuze et al., 2020; Jeger et al., 2023).

2. PCR en tiempo real (qPCR).

Permite no solo detectar sino también cuantificar la concentración del virus en la muestra. Esto es importante para evaluar la carga viral y predecir la gravedad de la enfermedad.

3. Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).

Este método no requiere un termociclador complejo, ya que la reacción transcurre a temperatura constante (unos 60–65 °C). El LAMP posee alta sensibilidad y especificidad, y los resultados pueden verse a simple vista (por el cambio de color o la turbidez de la solución). Es prometedor para el diagnóstico de campo (Jeger et al., 2023; Kreuze et al., 2020).

4. Hibridación de ADN.

El método se basa en la capacidad de las cadenas complementarias de ácidos nucleicos de unirse entre sí. Las sondas de ADN marcadas (radiactivas o quimioluminiscentes) se hibridan con el ARN o ADN viral aplicado sobre una membrana. El método es sensible, pero inferior a la PCR y requiere equipos especiales (Blancard, 2012).

Ventajas de los métodos moleculares:

• Máxima sensibilidad: detección de copias individuales del genoma.
• Especificidad: posibilidad de distinguir cepas cercanamente emparentadas.
• Trabajo con viroides: único método fiable para su diagnóstico.
• Rapidez: resultados en pocas horas.

Desventajas:

• Coste: los equipos y reactivos son caros.
• Resultados falsos positivos: posibles por contaminación de las muestras.
• Necesidad de laboratorio: la mayoría de los métodos requieren un laboratorio equipado y personal capacitado.

Secuenciación

La secuenciación de alto rendimiento (HTS) es un método revolucionario que permite leer la secuencia de ácidos nucleicos en una muestra sin conocimiento previo del patógeno. La HTS permite:

• Detectar virus conocidos y desconocidos.
• Analizar cuasiespecies y formas recombinantes.
• Estudiar la filogenia y la evolución de los virus.
• Realizar análisis metagenómicos de comunidades completas (Kreuze et al., 2020; Koonin, 2021).

La HTS se está convirtiendo en el estándar de oro para el cribado virológico, pero su aplicación está limitada por el coste y la necesidad de procesamiento bioinformático de los datos.

Diagnóstico CRISPR

El diagnóstico CRISPR es la dirección más reciente, que combina la amplificación isotérmica con sistemas CRISPR-Cas. Por ejemplo, el sistema SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) utiliza Cas13 para detectar ARN, y DETECTR utiliza Cas12 para detectar ADN. Estos sistemas poseen alta sensibilidad y especificidad, y también pueden adaptarse para condiciones de campo (Jeger et al., 2023). Por ahora el diagnóstico CRISPR se encuentra en fase de desarrollo experimental, pero en el futuro puede convertirse en una potente herramienta para la identificación rápida de virus y viroides.

Problemas del diagnóstico

Incluso con métodos modernos, la identificación precisa puede verse dificultada por varios factores (Blancard, 2012; Jeger et al., 2023):

• Título bajo: en las etapas tempranas de la infección la concentración del virus puede estar por debajo del umbral de sensibilidad del método.
• Infecciones latentes: el virus está presente en la planta pero no hay síntomas, lo que dificulta la detección.
• Infecciones mixtas: una planta puede estar infectada simultáneamente por varios virus, lo que distorsiona los síntomas y puede provocar reacciones cruzadas.
• Cuasiespecies: la alta variabilidad genética hace que los cebadores o anticuerpos puedan no reconocer todas las variantes.
• Inhibidores en el jugo vegetal: algunos componentes del jugo pueden suprimir la PCR o el ELISA.

Para superar estos problemas se utiliza un enfoque integral: la combinación de métodos biológicos, serológicos y moleculares. Por ejemplo, en la certificación de la papa se aplican inspecciones visuales, ELISA para el cribado masivo y RT-PCR para la confirmación y la detección de infecciones latentes (Le Hingrat and Quéré, 2023).